犢牛大腸桿菌性腹瀉是牛場(chǎng)常發(fā)且危害嚴(yán)重的一種細(xì)菌性傳染病，主要表現(xiàn)為腸炎或敗血癥，是新生犢牛死亡的主要病因之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無有效預(yù)防該病的商品化疫苗，因此，研制有效的針對(duì)該病的疫苗對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。引起犢牛腹瀉的大腸桿菌主要毒力因子有腸毒素（包括LT、ST）、志賀毒素和粘附素。LT和LTB具有很強(qiáng)的免疫原性并且具有免疫佐劑的功效，是近些年來疫苗研究的熱點(diǎn)。志賀毒素引起的犢牛腹瀉的死亡率最高，它有兩個(gè)型，1型和2型，2型志賀毒素的毒性強(qiáng)于1型，是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的重要毒力因子，其B亞基無毒且具有免疫原性。ST單獨(dú)不具有免疫原性，而粘附素的抗原類型又過多，因此，將大腸桿菌不耐熱腸毒素和志賀毒素作為疫苗抗原是研制犢牛大腸桿菌疫苗的主要策略。本研究旨在探索ltb和stx2b融合編碼基因的構(gòu)建，在原核系統(tǒng)中表達(dá)，以及表達(dá)蛋白誘導(dǎo)小鼠體液免疫的情況，為犢牛大腸桿菌疫苗的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究將PCR擴(kuò)增出的ltb和stx2b基因用一段柔性linker序列連接后插入pMD18T simple載體中，經(jīng)序列分析鑒定后，再通過酶切，連接，轉(zhuǎn)化宿主菌R... 

【文章頁(yè)數(shù)】：162 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 犢牛腹瀉概述
        1.1.1 病毒性腹瀉
        1.1.2 細(xì)菌性腹瀉
        1.1.3 寄生蟲性腹瀉
    1.2 犢牛大腸桿菌性腹瀉
        1.2.1 病原學(xué)
        1.2.2 流行特點(diǎn)
        1.2.3 臨床癥狀及病理變化
        1.2.4 防治
    1.3 大腸桿菌毒力因子
        1.3.1 粘附素
        1.3.2 腸毒素
        1.3.3 志賀毒素
    1.4 大腸桿菌疫苗的研究進(jìn)展
        1.4.1 滅活苗
        1.4.2 亞單位疫苗
        1.4.3 核酸疫苗
        1.4.4 活載體疫苗
    1.5 研究目的與意義
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 ltb 與 stx2b 融合基因的構(gòu)建
        2.2.2 重組蛋白 LTB-Stx2B 的表達(dá)與鑒定
        2.2.3 重組蛋白 Stx2B 的表達(dá)與鑒定
        2.2.4 重組蛋白純化
        2.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫
        2.2.6 免疫抗體檢測(cè)
        2.2.7 體內(nèi)中和試驗(yàn)
        2.2.8 體外中和試驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 ltb-stx2b 融合基因的構(gòu)建
        3.1.1 ltb 基因的擴(kuò)增
        3.1.2 stx2b 基因的擴(kuò)增
        3.1.3 ltb-stx2b 基因擴(kuò)增
        3.1.4 ltb-stx2b 重組基因序列的測(cè)定
    3.2 重組蛋白 LTB-Stx2B 的表達(dá)
        3.2.1 重組 E.coli Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B 的表達(dá)
        3.2.2 重組 E.coli Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B 的表達(dá)
    3.3 重組蛋白 Stx2B 的表達(dá)與鑒定
        3.3.1 stx2b 基因的擴(kuò)增
        3.3.2 stx2b 重組基因序列的測(cè)定
        3.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒 pCold I-Stx2B 的鑒定
        3.3.4 重組 E.coli Rosetta/pCold-I-Stx2B 的表達(dá)與鑒定
    3.4 免疫原的制備
    3.5 免疫抗體的檢測(cè)
    3.6 體內(nèi)中和試驗(yàn)
        3.6.1 LT 和 Stx2 對(duì)小鼠的 LD50 的測(cè)定
        3.6.2 LT 的小鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)
        3.6.3 Stx2 的體內(nèi)中和試驗(yàn)
    3.7 體外中和試驗(yàn)
        3.7.1 Stx2 對(duì) Vero 細(xì)胞的毒性作用
        3.7.2 Stx2 對(duì) Vero 細(xì)胞 CD50 測(cè)定
        3.7.3 Stx2 的中和效價(jià)
4 討論
    4.1 融合 PCR 技術(shù)
    4.2 不同免疫原的免疫效力評(píng)價(jià)
    4.3 初乳對(duì)新生犢牛的重要性
    4.4 亞單位疫苗在牛病上的應(yīng)用研究
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛魏氏梭菌病概述[J]. 李長(zhǎng)安,王正園,常順蘭.  畜牧獸醫(yī)雜志. 2012(06)
[2]犢牛大腸桿菌病的綜合治療[J]. 辛彬,孫剛.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2012(10)
[3]犢牛大腸桿菌病的綜合防治[J]. 王麗華.  中國(guó)動(dòng)物保健. 2012(09)
[4]犢牛腹瀉病流行情況調(diào)查與解決措施[J]. 廖黨金,葉勇剛,汪明,何萬(wàn)平,徐文福,潘保良,李江凌,謝晶,王秋實(shí),羅丹丹,于吉鋒.  中國(guó)奶牛. 2012(16)
[5]犢牛腹瀉的類型與防治措施[J]. 周鑫鑫.  畜禽業(yè). 2012(06)
[6]犢牛大腸桿菌病的防治[J]. 魏海龍.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2012(02)
[7]雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫雞中和抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)力的相關(guān)關(guān)系[J]. 李林,景小冬,章振華,鄭小蘭,姜北宇,張建偉.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2011(07)
[8]牛腹瀉類疾病的鑒別診斷及防治[J]. 吳云峰.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問. 2011(07)
[9]豬乙型腦炎病毒3種滅活疫苗的制備及免疫效果比較[J]. 喬進(jìn)平,趙明秋,張學(xué)濤,李銀光,李?yuàn)檴?劉薇,陳金頂.  華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(02)
[10]牛球蟲病診斷防治技術(shù)[J]. 王福剛.  中國(guó)畜禽種業(yè). 2011(03)

博士論文
[1]斷奶仔豬源大腸桿菌毒力因子的分子流行病學(xué)及F18菌毛部分特性的研究[D]. 成大榮.揚(yáng)州大學(xué) 2005

碩士論文
[1]豬瘟病毒四種不同抗原卵黃抗體中和效力評(píng)價(jià)[D]. 江馗語(yǔ).東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]豬水腫病大腸桿菌毒力因子雞卵黃抗體制備及Stx2e基因LAMP方法建立[D]. 馮瑜菲.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]大腸桿菌LTB增強(qiáng)PRRSV-GP5蛋白免疫原性的研究[D]. 王朝文.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[4]EHEC O157主要毒素基因克隆表達(dá)及單克隆抗體制備與鑒定[D]. 洪杰華.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[5]大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的克隆、改造及表達(dá)[D]. 韓冬梅.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[6]新生仔豬源大腸桿菌主要毒力因子的分子流行病學(xué)及其免疫防制[D]. 高小攀.揚(yáng)州大學(xué) 2009
[7]結(jié)核桿菌phoP突變株的構(gòu)建及鑒定[D]. 高永明.華北煤炭醫(yī)學(xué)院 2009
[8]大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的構(gòu)建及其粘膜免疫劑活性的研究與B亞單位單克隆抗體的制備[D]. 吳麗艷.揚(yáng)州大學(xué) 2008
[9]犢牛腹瀉大腸桿菌LEE和HPI毒力島相關(guān)基因的檢測(cè)及特性分析[D]. 方光遠(yuǎn).南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[10]致豬水腫病大腸桿菌ELISA抗體檢測(cè)方法及基因工程亞單位疫苗的初步研究[D]. 林藝遠(yuǎn).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



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