防御素是一種廣泛分布的小型陽離子抗菌肽,富含精氨酸,具有廣譜、高效的抗菌活性,同時對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等具有一定的抑菌效果,防御素的抗菌機(jī)理與抗生素抑菌機(jī)理完全不同,細(xì)菌無耐藥性產(chǎn)生,因此防御素有望成為替代抗生素的新型抗菌藥物。從生物體中提取防御素則量少、成本高、活性較低,因此通過分子改造或全新設(shè)計生產(chǎn),表達(dá)高活性防御素的研究具有重要意義。本課題以山羊β-防御素作為模板研究防御素蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)對其抗菌活性的影響。在不改變原始序列氨基酸保守區(qū)域組成的情況下對山羊β-防御素蛋白的氨基酸進(jìn)行隨機(jī)替換得到了29477條序列的防御素改造基因庫,預(yù)測蛋白質(zhì)的生理生化指標(biāo)將它們分成5大類,從中篩選出12條設(shè)計防御素（DGBD1-12）,其中疏水指數(shù)較高的序列：DGBD1-3；不穩(wěn)定指數(shù)較低,接近于原防御素的序列：DGBD4-6；精氨酸含量較高,其正電荷也較高的序列：DGBD7-9；等電點(diǎn)較好,接近于原防御素的序列：DGBD10-12。根據(jù)山羊p-防御素1的序列,利用畢赤酵母密碼子偏好性設(shè)計含有部分互補(bǔ)序列的引物,在引物兩端引入EcoR I和Not Ⅰ兩個限制性內(nèi)酶切位點(diǎn),通過重疊PCR法和... 

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表(Abbreviation)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 防御素及其種類
        1.1 α-防御素
        1.2 β-防御素
        1.3 θ-防御素
        1.4 昆蟲防御素
        1.5 植物防御素
    2 防御素的生物學(xué)活性
        2.1 抗細(xì)菌活性
        2.2 抗真菌活性
        2.3 抗病毒活性
        2.4 抗癌作用
        2.5 免疫調(diào)節(jié)作用
        2.6 細(xì)胞毒作用
        2.7 其他生物活性
    3 防御素作用機(jī)理
    4 影響防御素抗菌活性的構(gòu)效關(guān)系
    5 研究目的和意義
第二章 山羊β-防御素基因的體外改造
    1 引言
    2 試驗(yàn)材料
        2.1 基因序列
        2.2 分析工具
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 防御素替換序列的獲得
        3.2 改造防御素理化性質(zhì)的預(yù)測
        3.3 預(yù)測數(shù)據(jù)的SAS分析及序列的篩選
    4 結(jié)果與分析
        4.1 替換數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建
        4.2 替換后防御素的理化性質(zhì)預(yù)測
        4.3 SAS分析結(jié)果的方差分析
        4.4 正態(tài)分布分析及序列的選擇
    5 討論
第三章 山羊DGBD基因表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
    1 引言
    2 試驗(yàn)材料
        2.1 質(zhì)粒、菌株
        2.2 主要藥品及試劑
        2.3 常用試劑的配制
        2.4 主要儀器設(shè)備
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 DGBD基因的合成
            3.1.1 引物設(shè)計
            3.1.2 DGBD基因的PCR擴(kuò)增
            3.1.3 DGBD基因的克隆檢測
        3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.1 表達(dá)載體pPICZαA的制備
            3.2.2 表達(dá)載體pPICZαA雙酶切鑒定
            3.2.3 DGBD PCR純化產(chǎn)物雙酶切
            3.2.4 雙酶切產(chǎn)物的連接
            3.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.6 連接產(chǎn)物的鑒定
                3.2.6.1 雙酶切鑒定
                3.2.6.2 測序鑒定
        3.3 DGBD在畢赤酵母中的表達(dá)
            3.3.1 重組質(zhì)粒線性化
            3.3.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.3.3 線性化片段電轉(zhuǎn)GS115
            3.3.4 陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
            3.3.5 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4 蛋白濃度測定
        3.5 抑菌試驗(yàn)
            3.5.1 防御素最低抑菌濃度試驗(yàn)
            3.5.2 瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法
    4 結(jié)果與分析
        4.1 DGBD的PCR擴(kuò)增和序列分析
        4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            4.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定
            4.2.3 測序鑒定結(jié)果
        4.3 重組表達(dá)質(zhì)粒線性化檢測
        4.4 蛋白濃度檢測結(jié)果
        4.5 抑菌結(jié)果檢測
            4.5.1 十二株細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線
            4.5.2 改造防御素的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.5.3 改造防御素的瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.5.4 回歸分析
    5 討論
第四章 全文結(jié)論
    1 主要研究結(jié)果
    2 值得進(jìn)一步研究的相關(guān)問題
關(guān)鍵詞索引
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3663117