發(fā)布時間：2022-07-14 16:34

　　弓形蟲是頂復(fù)門寄生蟲中一種極具代表性的人獸共患病原。作為單細(xì)胞寄生蟲,它可以感染幾乎所有的溫血動物和這些宿主所有的有核細(xì)胞。為了適應(yīng)如此廣泛的細(xì)胞類型和宿主范圍,弓形蟲依賴一大批分泌蛋白來介導(dǎo)蟲體與宿主的互作,以滿足蟲體在不同寄生條件下的生長需求。致密顆粒蛋白（GRAs）和棒狀體蛋白（ROPs）是其中兩類重要的分泌蛋白,在蟲體的生長發(fā)育和免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用。截至目前,GRAs的家族成員研究不多,其組分有待挖掘;另一方面,大批ROPs已被發(fā)現(xiàn),但其工作的分子機制并不十分清楚。因此,本研究采用蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)來發(fā)掘新的致密顆粒蛋白,用酵母雙雜交技術(shù)篩選與弓形蟲棒狀體蛋白互作的宿主蛋白,具體的研究內(nèi)容包括以下兩個方面:（1）新型致密顆粒蛋白的篩選、鑒定和功能研究采用APEX和BirA*這兩種基于鄰近原則的蛋白標(biāo)記技術(shù),以已知的致密顆粒蛋白GRA1作為誘餌,我們對弓形蟲潛在的GRA蛋白進行了生物素標(biāo)記,并最終成功鑒定得到46個蛋白,其中包括20個已知的GRA蛋白和26個候選的GRAs。在這46個蛋白中,有17個是APEX和BirA*兩種方法共同鑒定得到的,而這17個蛋白中有14個是已知的... 

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語表
第一章 前言
    1.1 弓形蟲概述
        1.1.1 弓形蟲和弓形蟲病
        1.1.2 弓形蟲的生活史
        1.1.3 弓形蟲的宿主范圍和流行病學(xué)
    1.2 弓形蟲分泌蛋白的研究進展
        1.2.1 弓形蟲的分泌蛋白類型
        1.2.2 弓形蟲完成胞內(nèi)生長周期需要分泌蛋白的協(xié)助
        1.2.3 弓形蟲依賴分泌蛋白介導(dǎo)與宿主的互作
    1.3 蛋白標(biāo)記技術(shù)研究進展
        1.3.1 生物素——親和素系統(tǒng)
        1.3.2 生物素標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用
        1.3.3 其它標(biāo)記技術(shù)
    1.4 蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)的研究進展
        1.4.1 酵母雙雜交技術(shù)
        1.4.2 免疫共沉淀技術(shù)
        1.4.3 Pull-down技術(shù)
        1.4.4 其它方法
    1.5 研究目的和意義
第二章 新型致密顆粒蛋白的篩選、鑒定和功能研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 蟲株、菌株和細(xì)胞
        2.1.3 質(zhì)粒
        2.1.4 引物
        2.1.5 主要儀器與試劑
        2.1.6 主要溶液及配制
        2.1.7 實驗方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 生物素標(biāo)記質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 生物素標(biāo)記蟲株的構(gòu)建
        2.2.3 融合蛋白GRA1-APEX/BirA*的表達檢測
        2.2.4 生物素標(biāo)記蛋白的檢測
        2.2.5 標(biāo)記蛋白的富集純化
        2.2.6 蛋白質(zhì)譜分析
        2.2.7 新型致密顆粒蛋白的鑒定
        2.2.8 候選蛋白的定位分析
        2.2.9 致密顆粒蛋白的功能研究
    2.3 討論
        2.3.1 誘餌蛋白的選取、表達和比較
        2.3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理
        2.3.3 候選致密顆粒蛋白的分析
        2.3.4 依賴APEX和 BirA*催化的生物素標(biāo)記技術(shù)在弓形蟲的應(yīng)用
        2.3.5 APEX和 BirA*兩方法的比較
    2.4 小結(jié)
第三章 與棒狀體蛋白ROP16 互作宿主蛋白的篩選和鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株和細(xì)胞
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 引物
        3.1.4 主要儀器與試劑
        3.1.5 實驗方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 誘餌質(zhì)粒的自激活和毒性
        3.2.3 誘餌蛋白的表達檢測
        3.2.4 互作宿主蛋白的篩選
        3.2.5 互作結(jié)構(gòu)域的確定
        3.2.6 相互作用的驗證
    3.3 討論
        3.3.1 酵母雙雜交系統(tǒng)的選擇
        3.3.2 與ROP16 互作蛋白的篩選
    3.4 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3661491