豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。目前對PCV2的防控以疫苗免疫為主,市場上商品化PCV2疫苗有很多,其中大多數(shù)疫苗需要添加佐劑來提高免疫效應,傳統(tǒng)佐劑因其具有強大的免疫功效得到廣泛的應用,但同時也會引起一些毒副反應,對機體產生潛在的健康風險。近來,有研究顯示APCH1（Antigen presenting cells homing 1）重組單鏈抗體可以攜帶抗原靶向至抗原呈遞細胞（APCs）,并與主要組織相容性復合體II類分子（MHCII）的抗原位點結合,形成抗原肽-MHCII分子復合物,然后轉運至APCs表面供T淋巴細胞受體（TCR）識別,從而顯著增強亞單位疫苗的免疫效果。鑒于此,本研究利用桿狀病毒表達載體系統(tǒng),將APCH1與PCV2 Cap蛋白進行融合表達,構建了具有分子佐劑活性的PCV2亞單位基因工程疫苗,并在動物體內對所構建的疫苗進行了免疫效力評價。主要研究內容如下:1.重組桿狀病毒rBV-APCH1-Cap的構建及體外表達人工合成重組單鏈抗體APCH1基因以及昆蟲細胞密碼子優(yōu)化的PCV2 ORF2... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省211工程院校教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表(Abbreviation)
第一章 文獻綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒2型的分子生物學特性
        1.1.1 豬圓環(huán)病毒2型的病原特征
        1.1.2 PCV2基因組結構及編碼蛋白
        1.1.3 PCV2免疫原性蛋白的結構特點
        1.1.4 豬圓環(huán)病毒2型致病機理
    1.2 豬圓環(huán)病毒疫苗的研究進展
        1.2.1 全病毒滅活疫苗
        1.2.2 亞單位基因工程疫苗
        1.2.3 重組活載體疫苗
        1.2.4 核酸疫苗
    1.3 分子佐劑
    1.4 桿狀病毒表達系統(tǒng)
第二章 研究目的與意義
第三章 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、細胞和菌株
        3.1.2 載體、質粒和引物
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 免疫反應試驗所用抗原及血清
        3.1.5 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.1.6 主要緩沖液與相關試劑及其配制
        3.1.7 其它緩沖液及試劑
        3.1.8 實驗動物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PCV2的增殖
        3.2.2 限制性內切酶酶切反應
        3.2.3 PCR產物或酶切產物的電泳檢測
        3.2.4 酶切產物回收與純化
        3.2.5 外源DNA片段與質粒載體的連接反應
        3.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        3.2.7 連接產物的轉化
        3.2.8 質粒的制備與鑒定
        3.2.9 質粒DNA濃度的測定
        3.2.10 重組Bacmid DNA的提取
        3.2.11 重組桿狀病毒的制備
        3.2.12 Western blot試驗
        3.2.13 間接免疫熒光試驗(IFA)
        3.2.14 微量中和試驗
        3.2.15 間接ELISA
        3.2.16 飼養(yǎng)細胞的準備
        3.2.17 骨髓瘤細胞的復蘇活化及融合用骨髓瘤細胞的制備
        3.2.18 細胞融合
        3.2.19 陽性細胞孔的篩選
        3.2.20 陽性細胞的克隆
        3.2.21 單克隆抗體的大量制備
        3.2.22 抗體的純化
        3.2.23 過碘酸鈉氧化法制備HRP標記的單抗
        3.2.24 細胞免疫的檢測
        3.2.25 小鼠的免疫與攻毒保護性試驗
        3.2.26 組織病理變化分析
        3.2.27 統(tǒng)計學方法
第四章 結果與分析
    4.1 重組桿狀病毒rBV-APCH1-Cap的構建及融合蛋白的表達
        4.1.1 重組質粒pFastBac Dual-APCH1-△41ORF2的構建
        4.1.2 重組質粒pFastBac Dual-D-APCH1-△41ORF2的構建
        4.1.3 穿梭質粒Bacmid-APCH1-△41ORF2的構建
        4.1.4 重組桿狀病毒rBV-APCH1-Cap的制備
        4.1.5 重組桿狀病毒rBV-APCH1-Cap的純化與滴度測定
        4.1.6 間接免疫熒光試驗(IFA)檢測重組蛋白的表達
        4.1.7 Western blot檢測重組蛋白的表達
    4.2 豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白定量檢測方法的建立
        4.2.1 重組轉移質粒pFastBacDual-D-GP64SP-△ORF2-His的構建
        4.2.2 重組桿狀病毒rBV-D-Cap-His目的蛋白的表達
        4.2.3 抗原標準品的純化
        4.2.4 PCV2Cap蛋白單克隆抗體的制備及相關特性檢測
        4.2.5 雙抗夾心ELISA定量檢測Cap蛋白方法的建立
        4.2.6 重組目的蛋白APCH1-Cap和Cap的制備及定量
    4.3 重組亞單位疫苗APCH1-Cap在小鼠體內誘發(fā)的免疫保護
        4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗體水平
        4.3.2 免疫小鼠的中和抗體水平
        4.3.3 免疫小鼠淋巴細胞增殖檢測
        4.3.4 免疫小鼠淋巴細胞增殖的FCM檢測分析
        4.3.5 免疫小鼠脾細胞分泌的細胞因子水平分析
        4.3.6 實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠脾細胞中IFN-γmRNA表達
        4.3.7 攻毒后小鼠的組織病理變化
第五章 討論與結論
    5.1 討論
        5.1.1 雙抗夾心ELISA定量檢測免疫原性蛋白
        5.1.2 APCH1分子佐劑誘導體液免疫和細胞免疫的可能機制
        5.1.3 重組亞單位疫苗APCH1-Cap在小鼠體內誘導的保護性免疫
    5.2 結論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型疫苗與豬支原體肺炎疫苗混合免疫效果評價[J]. 趙海忠,李良華,王德才,宋忠旭,彭先文,梅書棋.  畜牧與獸醫(yī). 2019(03)
[2]豬圓環(huán)病毒2型ORF2與豬繁殖及呼吸綜合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表達[J]. 沈克飛,楊柳,楊睿,周雪,張素輝,付利芝.  中國生物制品學雜志. 2019(01)
[3]2017～2018年華中地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學分析[J]. 鄧文芳,宋文博,胡星星,賈雙,陳翔鴻,喻紅艷,湯細彪.  中國動物傳染病學報. 2020(02)
[4]四種常用化學消毒劑對豬2型圓環(huán)病毒殺滅效果研究[J]. 儲玉雙,李紅英,黃小紅.  湖北畜牧獸醫(yī). 2018(12)
[5]國內商品化豬圓環(huán)病毒2型疫苗效力檢驗方法之比較[J]. 何天慈,萬建青,鄒興啟,李翠,朱元源,徐嫄,趙啟祖.  中國獸醫(yī)雜志. 2018(11)
[6]豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究與應用[J]. 靳立明.  養(yǎng)殖與飼料. 2018(11)
[7]豬圓環(huán)病毒研究進展[J]. 何小莉,梁海英,曾智勇,湯德元,王彬,黃濤,徐國,葉百川,咸文,張愛瓊,陳娟,吳好葉.  豬業(yè)科學. 2018(09)
[8]豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進展[J]. 張愛瓊,梁海英,曾智勇,湯德元,王彬,黃濤,徐國,葉百川,咸文,何小莉.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2018(11)
[9]獸用疫苗佐劑的研究進展[J]. 鄧碧華,朱俊,馬鶴毓,徐海,盧宇.  畜牧獸醫(yī)科學(電子版). 2017(12)
[10]豬圓環(huán)病毒基因組結構與功能研究進展[J]. 代振江,王偉丞,曾智勇,湯德元,梁海英,劉釗,徐國,葉百川.  畜牧與獸醫(yī). 2016(03)

博士論文
[1]殼寡糖修飾豬圓環(huán)病毒疫苗的免疫原性及作用機制研究[D]. 張貴強.中國科學院大學(中國科學院過程工程研究所) 2018
[2]核定位信號肽介導豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白出核機制的研究[D]. 侯強.中國農業(yè)科學院 2018
[3]人感染圓環(huán)病毒的血清流行病學研究及新型抗圓環(huán)病毒疫苗的研制[D]. 于澄.吉林大學 2017
[4]PRRSV與PCV2的分子流行病學調查及其重組腺病毒疫苗實驗免疫研究[D]. 孫文超.廣西大學 2017
[5]靶向DEC-205的豬圓環(huán)病毒Capsid疫苗的設計及其免疫應答研究[D]. 潘玉竹.重慶大學 2014
[6]泛素蛋白酶體途徑在豬圓環(huán)病毒2型體外感染中的作用研究[D]. 程爽.華中農業(yè)大學 2014
[7]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的家蠶表達及亞單位疫苗在小鼠和仔豬的免疫效力試驗[D]. 郎洪武.中國農業(yè)大學 2013
[8]豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白病毒樣顆粒的制備及其免疫原性的研究[D]. 尹雙輝.中國農業(yè)科學院 2011
[9]豬圓環(huán)病毒2型的檢測及皂苷類化合物對核酸疫苗的免疫增強作用[D]. 楊宗照.浙江大學 2008
[10]豬圓環(huán)病毒Ⅱ對豬的實驗性感染及其Cap蛋白誘導的小鼠免疫應答類型[D]. 申會剛.浙江大學 2007

碩士論文
[1]PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二聯(lián)亞單位疫苗的初步研究[D]. 劉國陽.安徽農業(yè)大學 2018
[2]表達PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重組偽狂犬病病毒的構建及其免疫原性研究[D]. 謝永興.中國農業(yè)科學院 2018
[3]重組桿狀病毒高效表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析[D]. 張艷艷.吉林農業(yè)大學 2018
[4]桿狀病毒表達系統(tǒng)融合表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與口蹄疫病毒VP1蛋白及其免疫原性的研究[D]. 劉小康.浙江理工大學 2018
[5]PCV2感染對小鼠腸道黏膜免疫的影響[D]. 劉沅.湖南農業(yè)大學 2017
[6]表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白重組乳酸乳球菌的構建及其免疫效果評價[D]. 孫博.東北農業(yè)大學 2017
[7]表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組豬瘟兔化弱毒疫苗株的構建和鑒定[D]. 張玲楷.中國農業(yè)科學院 2017
[8]PCV2單克隆抗體的制備及多拷貝P28-ORF2重組豬痘病毒的構建[D]. 薛瑞.江西農業(yè)大學 2017
[9]攜帶遺傳標記的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆質粒的構建[D]. 代振江.貴州大學 2017
[10]豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Capsid表面Loop BC的結構與功能研究[D]. 劉思遠.湖南農業(yè)大學 2017



本文編號：3644143