犬細小病毒�。–anine parvovirus，CPV）在家養(yǎng)和野生的犬科動物傳染疾病中，是一種具有高度傳染性、致命性的疾病，由CPV引起犬的以劇烈嘔吐、便血，帶腥臭味水樣腹瀉、心肌炎、嚴重脫水為主要癥狀，以及白細胞顯著下降的傳染病。本試驗針對CPV感染建立了快速PCR診斷法，并應(yīng)用于臨床檢測；同時成功地克隆了CPV-VP2基因及對其原核表達，表達的CPV-VP2蛋白純化、復性后建立了CPV抗體檢測間接ELISA法，并初步應(yīng)用于臨床犬只血清中CPV抗體檢測。1.根據(jù)NBCI已知CPV基因序列，設(shè)計引物，以臨床可疑CPV感染樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，結(jié)果其與NCBI相關(guān)CPV核苷酸同源性在99.8～100%，證實所擴增產(chǎn)物為CPV基因。并對江西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)院收治的28例犬可疑CPV感染病例進行了臨床應(yīng)用檢測，結(jié)果本方法檢出率89.28%（25/28），膠體金檢測板檢測率71.42%（20/28），表明PCR檢測技術(shù)相對膠體金檢測板的靈敏度明顯更高。2.根據(jù)NBCI已知CPV基因序列，設(shè)計CPV VP2基因引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增出1755bp的VP2基因并克隆至T載體測序... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學江西省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮寫詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 犬細小病毒病的病原學
        1.1.1 CPV 的形態(tài)特征與理化特點
        1.1.2 CPV 的血凝特性
        1.1.3 CPV 的基因組結(jié)構(gòu)與編碼的蛋白
    1.2 犬細小病毒病的發(fā)病機理
    1.3 犬細小病毒株的出現(xiàn)以及在它們的分布
    1.4 犬細小病毒病的流行病學
    1.5 臨床癥狀和病理變化
        1.5.1 臨床癥狀
        1.5.2 病理變化
    1.6 犬細小病毒的實驗室診斷
        1.6.1 電子顯微鏡(EM)
        1.6.2 病毒的分離
        1.6.3 血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HI）
        1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
        1.6.5 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）
        1.6.6 環(huán)介導等溫擴增(LAMP)
        1.6.7 核酸測序
    1.7 犬細小病毒病的預(yù)防與控制
    1.8 本試驗研究目的與意義
第二章 犬細小病毒 PCR 檢測方法的建立與應(yīng)用
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
            2.1.1.1 待檢病料
            2.1.1.2 主要生化試劑
            2.1.1.3 主要試劑配制
            2.1.1.4 主要設(shè)備
        2.1.2 方法
            2.1.2.1 引物設(shè)計與合成
            2.1.2.2 樣品DNA的提取
            2.1.2.3 PCR 最佳退火溫度條件優(yōu)化
            2.1.2.4 PCR 擴增片段的測序與分析
            2.1.2.5 PCR 特異性試驗
            2.1.2.6 PCR 敏感性試驗
            2.1.2.7 臨床樣品的 PCR 檢測
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 最佳退火溫度條件優(yōu)化
        2.2.2 PCR 擴增片段的測序與分析結(jié)果
        2.2.3 PCR 特異性試驗結(jié)果
        2.2.4 PCR 敏感性試驗結(jié)果
        2.2.5 臨床應(yīng)用結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 犬細小病毒 VP2 基因克隆分析及原核表達
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 試驗病料
            3.1.1.2 試驗菌種與載體
            3.1.1.3 儀器設(shè)備
            3.1.1.4 主要生化試劑
            3.1.1.5 試劑和培養(yǎng)基的配制
            3.1.1.6 抽提質(zhì)粒緩沖液和溶液的配制
            3.1.1.7 SDS-PAGE 相關(guān)試劑配制
            3.1.1.8 蛋白純化與復性主要試劑的配制
        3.1.2 方法
            3.1.2.1 引物設(shè)計
            3.1.2.2 樣品 DNA 的提取
            3.1.2.3 VP2 基因的 PCR 擴增
            3.1.2.4 VP2 基因的 PCR 擴增產(chǎn)物純化
            3.1.2.5 VP2 基因的克隆
            3.1.2.6 重組質(zhì)粒 pGEM-T-VP2 的小量制備
            3.1.2.7 重組質(zhì)粒 pGEM-T-VP2 的雙酶切鑒定
            3.1.2.8 表達載體 pET32a-VP2 的構(gòu)建
            3.1.2.9 表達載體 pET32a-VP2 的雙酶切鑒定
            3.1.2.10 目的基因 VP2 在 BL21 中的誘導表達
            3.1.2.11 SDS-PAGE 分析
            3.1.2.12 表達條件的優(yōu)化
            3.1.2.13 表達蛋白的純化與復性
            3.1.2.14 蛋白濃度的測定
            3.1.2.15 表達 CPV-VP2 蛋白反應(yīng)性與免疫性的檢測
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 VP2 基因的 PCR 擴增結(jié)果
        3.2.2 重組 pGEM-T-VP2 的雙酶切鑒定結(jié)果
        3.2.3 重組 pGEM-T-VP2 的測序分析結(jié)果
            3.2.3.1 VP2 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果
            3.2.3.3 VP2 基因分子進化樹分析結(jié)果
        3.2.4 重組 pET32a-VP2 雙酶切鑒定結(jié)果
        3.2.5 表達蛋白的 SDS-PAGE 結(jié)果
        3.2.6 誘導表達時間的優(yōu)化結(jié)果
        3.2.7 IPTG 誘導濃度的優(yōu)化結(jié)果
        3.2.8 蛋白的表達形式分析結(jié)果
        3.2.9 VP2 蛋白的純化結(jié)果
        3.2.10 蛋白濃度的測定結(jié)果
        3.2.11 表達 VP2 蛋白反應(yīng)性的檢測
        3.2.12 表達 VP2 蛋白免疫原性的檢測
    3.3 討論
        3.3.1 VP2 基因
        3.3.2 VP2 蛋白
        3.3.3 蛋白純化與復性
    3.4 小結(jié)
第四章 犬細小病毒 VP2 蛋白間接 ELISA 方法的建立與應(yīng)用
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 試驗設(shè)備
            4.1.1.2 主要的試劑配制
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 CPV 抗體檢測間接 ELISA 相關(guān)條件的確定
            4.1.2.2 重復性試驗
            4.1.2.3 CPV 間接 ELISA 檢測陰、陽性的判定標準
            4.1.2.4 CPV 間接 ELISA 臨床應(yīng)用
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 表達 VP2 蛋白最佳包被濃度與犬血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
        4.2.2 HPR-羊抗犬 Ig G 濃度的確定
        4.2.3 最佳封閉液的確定
        4.2.4 包被液的確定
        4.2.5 重復性試驗
        4.2.6 CPV 間接 ELISA 檢測陰、陽性的判定標準
        4.2.7 CPV 間接 ELISA 臨床應(yīng)用
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]犬細小病毒病PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 陶明江,張祥華,孫明,余恩超,陸家卿,王萍,何后軍,鄔向東,戴益民.  生物災(zāi)害科學. 2013(04)
[2]犬細小病毒病基因工程疫苗的研究進展[J]. 徐進,孫世琪,曹隨忠,孫德惠,郭慧琛.  中國獸醫(yī)科學. 2012(05)
[3]外源蛋白在大腸桿菌中的表達定位策略[J]. 鐘向陽,石歆瑩,周宏灝.  生物工程進展. 2001(06)
[4]細小病毒的分子生物學[J]. 張英.  中國病毒學. 1996(03)
[5]犬細小病毒酶標試劑盒的研制[J]. 劉宏偉,田克恭,渠川玫,時彥勝,王樹勤,符兆英.  中國畜禽傳染病. 1994(06)
[6]某犬群爆發(fā)犬病毒性腸炎的流行病學和臨床病理學觀察[J]. 徐漢坤,金淮,郭寶發(fā),賴杰.  畜牧與獸醫(yī). 1983(05)

碩士論文
[1]北京地區(qū)犬細小病毒病的分子流行病學調(diào)查研究[D]. 柏麗華.中國農(nóng)業(yè)科學院 2011



本文編號：3638005