豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）是引發(fā)豬病毒性腹瀉的主要病原,且三種病原常常混合感染,建立同時(shí)檢測(cè)三種病原的特異性檢測(cè)方法,在臨床診斷上具有重要意義。本研究根據(jù)GenBank登錄的PEDV S基因、TGEV S基因和PoRV VP6基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)合成引物,建立了RT-PCR多重快速檢測(cè)方法。利用這3對(duì)引物對(duì)同一樣品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板析進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示：該方法可以同時(shí)擴(kuò)增PEDV S基因（682bp）, TGEV S基因（480bp）和PoRV VP6基因（297bp）的特異性DNA片段,其三對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)除白身病毒以外的其他兩種腹瀉病毒及豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性：敏感性測(cè)定結(jié)果表明,該多重RT-PCR方法檢測(cè)靈敏性分別達(dá)到PEDV模板3.3×103copies/μL、TGEV模板3.2×103copies/μL和PoRV模板2.8×103copies/μL。用20份臨床病料對(duì)本研究建立的多重RT-PCR和單-RT-PCR方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證,結(jié)果顯示：兩者的總符合率為100%... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 病原概述
        1.1.1 豬流行性腹瀉病毒
        1.1.2 豬傳染性胃腸炎病毒
        1.1.3 豬輪狀病毒
    1.2 PEDV、TGEV、PoRV的診斷方法
        1.2.1 臨床診斷
        1.2.2 實(shí)驗(yàn)室診斷
    1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
        1.3.1 原理
        1.3.2 分類
        1.3.3 應(yīng)用
    1.4 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒及臨床樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.1.4 病料樣品的處理
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 單一病原體基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序
        2.2.2 多重RT-PCR擴(kuò)增
        2.2.3 PCR產(chǎn)物的回收
        2.2.4 目的基因片段與pMD18-T載體的連接
        2.2.5 大腸桿菌JM-109感受態(tài)的制備
        2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.7 pMD18-T基因重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.8 測(cè)序及結(jié)果分析
        2.2.9 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        2.2.10 特異性試驗(yàn)
        2.2.11 敏感性試驗(yàn)
        2.2.12 重復(fù)性試驗(yàn)
        2.2.13 臨床感染病料的檢測(cè)
        2.2.14 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.2.15 熒光定量PCR的特異性
        2.2.16 熒光定量PCR的重復(fù)性
        2.2.17 熒光定量PCR的敏感性
        2.2.18 熒光定量PCR臨床樣品檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化結(jié)果
        3.1.1 單一RT-PCR擴(kuò)增及退火溫度的優(yōu)化結(jié)果
        3.1.2 多重RT-PCR引物濃度的優(yōu)化結(jié)果
        3.1.3 多重RT-PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
    3.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
    3.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
    3.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
    3.5 臨床樣品的檢測(cè)
    3.6 熒光定量PCR擴(kuò)增目的片段電泳結(jié)果
    3.7 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
    3.8 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
    3.9 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
    3.10 熒光定量PCR溶解曲線分析結(jié)果
    3.11 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果
    3.12 熒光定量PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果
4 討論
    4.1 多重RT-PCR方法檢測(cè)豬腹瀉病毒
    4.2 檢測(cè)豬腹瀉病毒的熒光定量PCR方法分析
5 結(jié)論
    5.1 建立了檢測(cè)PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法
    5.2 建立了檢測(cè)PEDV、TGEV、PoRV熒光定量PCR方法
    5.3 臨床樣品的檢測(cè)
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 張坤,何啟蓋.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(08)
[2]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 敖金霞,高學(xué)軍,仇有文,郭士成.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(06)
[3]豬輪狀病毒性腹瀉的ELISA雙抗夾心法檢測(cè)及防治建議[J]. 王玲,蒲萬霞,孟小琴,鄧海平,崔東安,焦碩,楊志強(qiáng).  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(05)
[4]豬傳染性胃腸炎分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展[J]. 徐麗秋,賈赟,劉海防,高玉峰,趙玉軍.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2008(08)
[5]水中輪狀病毒實(shí)時(shí)定量PCR外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建[J]. 胡秀華,何苗,劉麗,李丹,施漢昌.  環(huán)境科學(xué). 2008(02)
[6]應(yīng)用多重RT-PCR方法檢測(cè)158例豬糞樣中的兩種冠狀病毒[J]. 楊群,何孔旺,陸承平.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(04)
[7]應(yīng)用TGEV N蛋白McAb間接免疫熒光法檢測(cè)TGEV的研究[J]. 李丹丹,田志軍,姜騫,唐麗杰,李一經(jīng).  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2006(01)
[8]豬傳染性胃腸炎病毒在ST細(xì)胞中增殖規(guī)律的研究[J]. 周燕,王建超,華平,鄒勇,譚文松.  中國(guó)獸醫(yī)科技. 2005(06)
[9]豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株在不同細(xì)胞增殖特性的研究[J]. 郎景華,李一經(jīng),仇波,孫文毅,齊秀清.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2003(11)
[10]實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的介紹[J]. 張立國(guó),張琚.  生物技術(shù). 2003(02)



本文編號(hào)：3637026