人工授精技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn),但冷凍精液使用率僅約1%。主要原因在于在冷凍保存過程中,精子結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞,導(dǎo)致冷凍-復(fù)蘇后精子活力嚴(yán)重下降,配種受胎率降低,窩產(chǎn)仔數(shù)減少。盡管在冷凍稀釋液成分以及冷凍程序等方面做了大量工作,但效果仍不理想。研究表明冷凍參與精子中Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。然而,抗凍保護(hù)劑種類及濃度對細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspases基因表達(dá)的影響尚不清楚。因此,本研究以添加不同冷凍保護(hù)劑、糖類、抗氧化劑的豬冷凍精子為實(shí)驗(yàn)材料,采用qRT-PCR.Annexin V-FITC等技術(shù)分析解凍豬精子的活率、活力；檢測豬精子中Caspase基因在mRNA水平上的表達(dá)水平、Caspase蛋白酶活性以及冷凍-解凍后的豬精子膜上磷酯酰絲氨酸外翻（PS）的程度。結(jié)果如下：（1）GeNorm結(jié)果表明,PGK1,ACTB和RPL4在所有樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性高,NormFinder結(jié)果表明,GAPDH是最穩(wěn)定的基因。此外,BestKeeper結(jié)果表明,三個(gè)最穩(wěn)定的基因是PPIA,GAPDH和RPL4。用不同算法得到的參考基因的排名順序有一些差異�？傊�,根據(jù)循環(huán)閾值變異系數(shù)（Ct... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省211工程院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬冷凍精液人工授精現(xiàn)狀及存在的問題
    1.2 冷凍過程中的精子損傷
        1.2.1 結(jié)構(gòu)與功能損傷
        1.2.2 分子損傷
    1.3 豬精子冷凍保存添加劑概述
        1.3.1 滲透型抗凍劑
        1.3.2 糖類
        1.3.3 抗氧化劑
    1.4 Caspase家族概述
        1.4.1 Caspase的結(jié)構(gòu)、特點(diǎn)及分類
        1.4.2 Caspase的激活機(jī)制
    1.5 冷凍與細(xì)胞凋亡
    1.6 內(nèi)參篩選的重要性
    1.7 研究內(nèi)容與目的意義
2. 材料和方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 所用儀器設(shè)備
        2.1.3 藥品及主要試劑的配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
        2.2.2 豬精液冷凍程序
        2.2.3 精子Total RNA的提取
        2.2.4 精子Toal RNA質(zhì)檢
        2.2.5 cDNA的合成
        2.2.6 PCR引物設(shè)計(jì)
        2.2.7 RT-PCR
        2.2.8 熒光定量PCR
        2.2.9 內(nèi)參基因篩選
        2.2.10 凋亡試劑盒檢測精子冷凍-解凍后Caspase-3(-6/9、-8)的表達(dá)情況
        2.2.11 膜聯(lián)蛋白V的檢測
        2.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 內(nèi)參篩選結(jié)果
        3.1.1 RNA的質(zhì)量
        3.1.2 候選內(nèi)參基因的驗(yàn)證,擴(kuò)增效率和表達(dá)水平
        3.1.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性
        3.1.4 綜合排名順序
    3.2 豬精子冷凍-解凍后的活率與活力
    3.3 冷凍對Caspase表達(dá)的影響
        3.3.1 冷凍稀釋液中抗凍劑3%甘油、DMSO、乙二醇對Caspase基因表達(dá)的影響
        3.3.2 冷凍稀釋液中添加糖類對Caspase基因表達(dá)的影響
        3.3.3 冷凍稀釋液中添加抗氧化劑對Caspase基因表達(dá)的影響
    3.4 冷凍對Caspases蛋白酶活性水平的影響
    3.5 冷凍對膜聯(lián)蛋白V影響的結(jié)果
4 討論
    4.1 內(nèi)參基因篩選結(jié)果
    4.2 豬精子冷凍-解凍后精子的活率與活力
    4.3 冷凍-解凍后Caspase基因的表達(dá)情況
    4.4 冷凍-解凍后Caspase蛋白酶活性
    4.5 膜聯(lián)蛋白V-FITC染色
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表文章


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對精子發(fā)生發(fā)育及冷凍保存的影響[J]. 丁麗,曾長軍.  中國畜牧獸醫(yī). 2013(04)
[2]保護(hù)劑在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用[J]. 李益得.  貴州畜牧獸醫(yī). 2012(06)
[3]中藥多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J]. 荊雪寧,武繼彪.  中國中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2012(08)
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[10]豬精子冷凍損傷研究進(jìn)展[J]. 陳曉麗,朱化彬,郝海生,杜衛(wèi)華,趙學(xué)明,孫艷艷,胡傳活,王棟.  中國生物工程雜志. 2010(07)

碩士論文
[1]冷凍稀釋液中添加抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的影響[D]. 任俊玲.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[2]大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及PACAP干預(yù)性治療的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 王克強(qiáng).第三軍醫(yī)大學(xué) 2005



本文編號：3633510