人工授精技術已廣泛應用于現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn),但冷凍精液使用率僅約1%。主要原因在于在冷凍保存過程中,精子結構和功能受到嚴重破壞,導致冷凍-復蘇后精子活力嚴重下降,配種受胎率降低,窩產(chǎn)仔數(shù)減少。盡管在冷凍稀釋液成分以及冷凍程序等方面做了大量工作,但效果仍不理想。研究表明冷凍參與精子中Caspase介導的細胞凋亡過程。然而,抗凍保護劑種類及濃度對細胞凋亡相關Caspases基因表達的影響尚不清楚。因此,本研究以添加不同冷凍保護劑、糖類、抗氧化劑的豬冷凍精子為實驗材料,采用qRT-PCR.Annexin V-FITC等技術分析解凍豬精子的活率、活力；檢測豬精子中Caspase基因在mRNA水平上的表達水平、Caspase蛋白酶活性以及冷凍-解凍后的豬精子膜上磷酯酰絲氨酸外翻（PS）的程度。結果如下：（1）GeNorm結果表明,PGK1,ACTB和RPL4在所有樣品中的表達穩(wěn)定性高,NormFinder結果表明,GAPDH是最穩(wěn)定的基因。此外,BestKeeper結果表明,三個最穩(wěn)定的基因是PPIA,GAPDH和RPL4。用不同算法得到的參考基因的排名順序有一些差異�？傊�,根據(jù)循環(huán)閾值變異系數(shù)（Ct... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省211工程院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 豬冷凍精液人工授精現(xiàn)狀及存在的問題
    1.2 冷凍過程中的精子損傷
        1.2.1 結構與功能損傷
        1.2.2 分子損傷
    1.3 豬精子冷凍保存添加劑概述
        1.3.1 滲透型抗凍劑
        1.3.2 糖類
        1.3.3 抗氧化劑
    1.4 Caspase家族概述
        1.4.1 Caspase的結構、特點及分類
        1.4.2 Caspase的激活機制
    1.5 冷凍與細胞凋亡
    1.6 內參篩選的重要性
    1.7 研究內容與目的意義
2. 材料和方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 所用儀器設備
        2.1.3 藥品及主要試劑的配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 試驗設計
        2.2.2 豬精液冷凍程序
        2.2.3 精子Total RNA的提取
        2.2.4 精子Toal RNA質檢
        2.2.5 cDNA的合成
        2.2.6 PCR引物設計
        2.2.7 RT-PCR
        2.2.8 熒光定量PCR
        2.2.9 內參基因篩選
        2.2.10 凋亡試劑盒檢測精子冷凍-解凍后Caspase-3(-6/9、-8)的表達情況
        2.2.11 膜聯(lián)蛋白V的檢測
        2.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
3 結果與分析
    3.1 內參篩選結果
        3.1.1 RNA的質量
        3.1.2 候選內參基因的驗證,擴增效率和表達水平
        3.1.3 候選內參基因的表達穩(wěn)定性
        3.1.4 綜合排名順序
    3.2 豬精子冷凍-解凍后的活率與活力
    3.3 冷凍對Caspase表達的影響
        3.3.1 冷凍稀釋液中抗凍劑3%甘油、DMSO、乙二醇對Caspase基因表達的影響
        3.3.2 冷凍稀釋液中添加糖類對Caspase基因表達的影響
        3.3.3 冷凍稀釋液中添加抗氧化劑對Caspase基因表達的影響
    3.4 冷凍對Caspases蛋白酶活性水平的影響
    3.5 冷凍對膜聯(lián)蛋白V影響的結果
4 討論
    4.1 內參基因篩選結果
    4.2 豬精子冷凍-解凍后精子的活率與活力
    4.3 冷凍-解凍后Caspase基因的表達情況
    4.4 冷凍-解凍后Caspase蛋白酶活性
    4.5 膜聯(lián)蛋白V-FITC染色
5 結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表文章


【參考文獻】：
期刊論文
[1]半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶介導的細胞凋亡對精子發(fā)生發(fā)育及冷凍保存的影響[J]. 丁麗,曾長軍.  中國畜牧獸醫(yī). 2013(04)
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[3]中藥多糖誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展[J]. 荊雪寧,武繼彪.  中國中西醫(yī)結合雜志. 2012(08)
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[10]豬精子冷凍損傷研究進展[J]. 陳曉麗,朱化彬,郝海生,杜衛(wèi)華,趙學明,孫艷艷,胡傳活,王棟.  中國生物工程雜志. 2010(07)

碩士論文
[1]冷凍稀釋液中添加抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的影響[D]. 任俊玲.四川農(nóng)業(yè)大學 2007
[2]大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡及PACAP干預性治療的實驗研究[D]. 王克強.第三軍醫(yī)大學 2005



本文編號：3633510