口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是一種可引起偶蹄動物發(fā)病的高度接觸性傳染病。該病是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的,典型癥狀是病畜高熱,跛行,在蹄部、舌、口、乳房等處產(chǎn)生水泡,該病發(fā)病率高,但死亡率低,造成了很大的經(jīng)濟損失。目前對于該病的防治主要通過疫苗接種,但是FMDV有七個不同的血清型,抗原變異快,不同血清型之間沒有交叉保護,因而給本病的預防帶來一定的困難。另外,目前主要使用的是滅活疫苗,但其在使用和生產(chǎn)過程中存在安全風險,因此研制安全、高效的新型生物制劑成為越來越多研究者關注的問題。干擾素（IFN）是一種多效的細胞因子,它能作用于相應的受體,激活信號通路并誘導干擾素刺激基因（ISGs）的大量轉錄,表達相關的功能性蛋白,最終起到抗病毒作用。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素作用于不同的受體,有協(xié)同抗病毒效果。IFITM3是由IFN誘導產(chǎn)生的一種跨膜蛋白家族成員,在抗病毒、抗腫瘤及免疫監(jiān)視等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來桿狀病毒越來越多的應用到研究和臨床生產(chǎn)中,不僅在于其自身在表達修飾方面的優(yōu)勢,它還不存在安全性問... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語列表(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 口蹄疫簡介
        1.1.1 簡述口蹄疫的危害及其現(xiàn)狀
        1.1.2 口蹄疫病毒的分子生物學
        1.1.3 口蹄疫現(xiàn)狀及新型口蹄疫疫苗
            1.1.3.1 傳統(tǒng)疫苗
            1.1.3.2 新型FMD疫苗
    1.2 干擾素簡介
        1.2.1 干擾素的發(fā)展和作用
        1.2.2 干擾素的分型
        1.2.3 IFN的誘導表達
        1.2.4 IFN的作用機理
        1.2.5 干擾素刺激基因(ISGs)
        1.2.6 干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)
    1.3 桿狀病毒表達系統(tǒng)
        1.3.1 簡述桿狀病毒
        1.3.2 桿狀病毒作為載體的進展
        1.3.3 桿狀病毒作為載體的優(yōu)勢
2 目的和意義
3 材料和方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌種、細胞及毒株
        3.1.2 質(zhì)粒載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 主要緩沖液
            3.1.5.1 質(zhì)粒提取緩沖液
            3.1.5.2 Western blot緩沖液
        3.1.6 其他溶液
        3.1.7 本實驗所用各種PCR引物
    3.2 試驗方法
        3.2.1 PCR獲得目的基因
        3.2.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應
        3.2.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測
        3.2.4 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.5 外源DNA片段與載體的連接反應
        3.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.7 連接產(chǎn)物的轉化
        3.2.8 重組質(zhì)粒的小量制備(OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒)
        3.2.9 質(zhì)粒DNA的定量
        3.2.10 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.11 藍白斑篩選
        3.2.12 重組穿梭載體(Bacmid)的提取
        3.2.13 脂質(zhì)體介導的轉染
        3.2.14 重組假型桿狀病毒轉導哺乳動物細胞
        3.2.15 構建重組假型桿狀病毒的操作流程及示意圖
        3.2.16 Western blot檢測目的蛋白的表達
            3.2.16.1 樣品的處理
            3.2.16.2 SDS-PAGE電泳
            3.2.16.3 Western blot檢測
        3.2.17 空斑減少試驗檢測
        3.2.18 熒光定量PCR
            3.2.18.1 樣品的制備
            3.2.18.2 總RNA的提取
            3.2.18.3 cDNA的合成
            3.2.18.4 實時熒光定量PCR檢測
                3.2.18.4.1 實時熒光定量PCR試驗
                3.2.18.4.2 實時熒光PCR相對定量mRNA表達水平的計算
        3.2.19 動物試驗
            3.2.19.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的動物試驗方案
            3.2.19.2 動物試驗血清的中和抗體檢測
            3.2.19.3 動物試驗血清的ELISA抗體檢測
            3.2.19.4 動物試驗血清的ELISA抗體檢測(韓國金諾ELISA試劑盒)
            3.2.19.5 外周血單個核細胞(PBMCs)細胞的分離
        3.2.20 統(tǒng)計學方法
4 結果與分析
    4.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的構建及抗病毒活性的研究
        4.1.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的構建
            4.1.1.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的構建
                4.1.1.1.1 重組轉移載體的構建
                4.1.1.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的獲得
                4.1.1.1.3 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的Western blot檢測
            4.1.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ的獲得
                4.1.1.2.1 重組轉移載體的構建
                4.1.1.2.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ的獲得
            4.1.1.3 重組桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的獲得
                4.1.1.3.1 轉移載體的構建
                4.1.1.3.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的獲得
                4.1.1.3.3 重組桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的Western blot檢測
            4.1.1.4 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的抗病毒效果檢測
                4.1.1.4.1 Ac-VSVG-IFN-α在細胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.2 Ac-VSVG-IFN-γ在細胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.3 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ轉導細胞后ISGs的轉錄
                4.1.1.4.4 Ac-VSVG-sIFITM3在細胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.5 重組桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應的初步探索
                    4.1.1.4.5.1 Ac-VSVG-IFN-α和Ac-VSVG-IFN-γ的協(xié)同抗病毒效應
                    4.1.1.4.5.2 Ac-VSVG-IFN-γ和Ac-VSVG-sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應
                    4.1.1.4.5.3 Ac-VSVG-IFN-γ/sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應
    4.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的構建及免疫效力試驗
        4.2.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的獲得
            4.2.1.1 FMDV P1基因的獲得和轉移載體的構建
            4.2.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的獲得
        4.2.2 Ac-VSVG-IFN-γ-2P1在細胞上的抗病毒效果
        4.2.3 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的動物試驗
            4.2.3.1 動物試驗血清ELISA水平的檢測
            4.2.3.2 中和抗體水平的檢測
            4.2.3.3 PBMCs中ISGs的檢測
5 討論
6 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3605708