超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）是一類非常普遍的抗氧化酶,能夠保護細胞免受活性氧的損害。目的：本研究目的在于通過構(gòu)建人參超氧化物歧化酶（pCu/Zn-SOD）、人銅鋅超氧化物歧化酶（hCu/Zn-SOD）基因與pET-22b載體的重組體系,獲得重組質(zhì)粒,實現(xiàn)兩種酶的表達、純化,并進行活性分析,以獲得高表達量和高活性的SOD,以用于動物疾病的檢測與防治。方法：（1）提取人參和人的總RNA,并通過RT-PCR獲得目的基因。將目的基因與pET-22b （+）載體連接,采用雙酶切和PCR檢測以證明載體構(gòu)建成功,然后測序。（2）將pET-22b-Cu/ZnSOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21進行誘導表達,收集上清并濃縮,利用superdex75分子篩層析和DEAE Fast Flow離子交換層析進行蛋白純化。（3）利用Bradford方法測定蛋白濃度,并用鄰苯三酚法測定酶活性。（4）利用SWISS-Model對pCu/Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)進行了預測,并與hCu/Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)進行了比較。（5）探討了不同溫度和不同pH對酶活性的影響。結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了重組質(zhì)... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學福建省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 超氧化物歧化酶的研究
    2 人參銅鋅超氧化物歧化酶研究
    3 生物體內(nèi)的氧化及抗氧化
        3.1 自由基、活性氧
        3.2 非酶類抗氧化分子簡介
    4 超氧化物歧化酶的作用機制
    5 超氧化物歧化酶的應用
        5.1 抗腫瘤和抗輻射
        5.2 防治心腦血管疾病
        5.3 作為某些疾病的檢測指標
        5.4 具有抗炎癥作用
        5.5 用于動物保健
    6 蛋白質(zhì)濃度的測定方法
        6.1 雙縮脲法
        6.2 考馬斯亮藍法
        6.3 紫外分光光度法
        6.4 BCA法
    7 超氧化物歧化酶的活性測定
    8 超氧化物歧化酶吸收機制
    9 SOD的獲得途徑
        9.1 植物SOD的提取
        9.2 動物SOD的提取
        9.3 利用基因手段獲得高純度SOD
    10 研究目的及意義
第二章 人和人參Cu/Zn-SOD基因表達載體的構(gòu)建
    1 材料
        1.1 工具酶和其它指示劑
        1.2 主要溶液的配制
        1.3 培養(yǎng)基
        1.4 主要使用儀器
    2 方法
        2.1 SWISS同源建模
        2.2 總RNA的提取
        2.3 CDNA的合成
        2.4 引物的設計與合成
        2.5 目的基因的克隆
        2.6 1%瓊脂糖凝膠電泳
        2.7 PCR產(chǎn)物的回收純化
        2.8 目的基因的酶切、連接、轉(zhuǎn)化
            2.8.1 載體和基因的酶切
            2.8.2 T4酶連接
            2.8.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化入DH5a
        2.9 重組載體正確性鑒定
            2.9.1 重組質(zhì)粒提取
            2.9.2 質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 SWISS-MODEL同源建模分析
        3.2 基因擴增PCR結(jié)果
        3.3 兩種酶構(gòu)建載體正確性驗證
        3.4 測序結(jié)果與分析
    4 討論
        4.1 載體的選擇
        4.2 酶切位點及抗生素的使用選擇
        4.3 SWISS建模
第三章 人和人參Cu/Zn-SOD蛋白的表達純化及活性分析
    1 材料與方法
        1.1 主要溶液的配制
        1.2 主要使用儀器及設備
    2 方法
        2.1 SOD蛋白的表達
            2.1.1 SOD在不同濃度IPTG濃度下的表達情況
            2.1.2 SOD在不同誘導時間下的表達情況
            2.1.3 SOD在不同溫度下的表達情況
        2.2 蛋白純化
            2.2.1 Superdex 75 10/300 GL純化
            2.2.2 Hitrap DEAE FF純化
        2.3 蛋白濃度的測定
        2.4 SOD蛋白的活性測定
        2.5 不同PH對兩種酶活性的影響
        2.6 不同溫度對兩種酶活性的影響
    3 結(jié)果與分析
        3.1 SOD表達結(jié)果
        3.2 SOD時間梯度誘導結(jié)果
        3.3 SOD溫度梯度誘導結(jié)果
        3.4 SOD IPTG濃度梯度誘導結(jié)果
        3.5 SOD純化結(jié)果
        3.6 SOD濃度的測定
        3.7 SOD活性鑒定結(jié)果
        3.8 溫度對SOD活性的影響
        3.9 PH對SOD活性的影響
    4 討論
        4.1 蛋白誘導表達
        4.2 蛋白純化及活性測定
結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3599081