超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）是一類非常普遍的抗氧化酶,能夠保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的損害。目的：本研究目的在于通過構(gòu)建人參超氧化物歧化酶（pCu/Zn-SOD）、人銅鋅超氧化物歧化酶（hCu/Zn-SOD）基因與pET-22b載體的重組體系,獲得重組質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)兩種酶的表達(dá)、純化,并進(jìn)行活性分析,以獲得高表達(dá)量和高活性的SOD,以用于動(dòng)物疾病的檢測(cè)與防治。方法：（1）提取人參和人的總RNA,并通過RT-PCR獲得目的基因。將目的基因與pET-22b （+）載體連接,采用雙酶切和PCR檢測(cè)以證明載體構(gòu)建成功,然后測(cè)序。（2）將pET-22b-Cu/ZnSOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集上清并濃縮,利用superdex75分子篩層析和DEAE Fast Flow離子交換層析進(jìn)行蛋白純化。（3）利用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度,并用鄰苯三酚法測(cè)定酶活性。（4）利用SWISS-Model對(duì)pCu/Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),并與hCu/Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。（5）探討了不同溫度和不同pH對(duì)酶活性的影響。結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了重組質(zhì)... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 超氧化物歧化酶的研究
    2 人參銅鋅超氧化物歧化酶研究
    3 生物體內(nèi)的氧化及抗氧化
        3.1 自由基、活性氧
        3.2 非酶類抗氧化分子簡介
    4 超氧化物歧化酶的作用機(jī)制
    5 超氧化物歧化酶的應(yīng)用
        5.1 抗腫瘤和抗輻射
        5.2 防治心腦血管疾病
        5.3 作為某些疾病的檢測(cè)指標(biāo)
        5.4 具有抗炎癥作用
        5.5 用于動(dòng)物保健
    6 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法
        6.1 雙縮脲法
        6.2 考馬斯亮藍(lán)法
        6.3 紫外分光光度法
        6.4 BCA法
    7 超氧化物歧化酶的活性測(cè)定
    8 超氧化物歧化酶吸收機(jī)制
    9 SOD的獲得途徑
        9.1 植物SOD的提取
        9.2 動(dòng)物SOD的提取
        9.3 利用基因手段獲得高純度SOD
    10 研究目的及意義
第二章 人和人參Cu/Zn-SOD基因表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料
        1.1 工具酶和其它指示劑
        1.2 主要溶液的配制
        1.3 培養(yǎng)基
        1.4 主要使用儀器
    2 方法
        2.1 SWISS同源建模
        2.2 總RNA的提取
        2.3 CDNA的合成
        2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.5 目的基因的克隆
        2.6 1%瓊脂糖凝膠電泳
        2.7 PCR產(chǎn)物的回收純化
        2.8 目的基因的酶切、連接、轉(zhuǎn)化
            2.8.1 載體和基因的酶切
            2.8.2 T4酶連接
            2.8.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化入DH5a
        2.9 重組載體正確性鑒定
            2.9.1 重組質(zhì)粒提取
            2.9.2 質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 SWISS-MODEL同源建模分析
        3.2 基因擴(kuò)增PCR結(jié)果
        3.3 兩種酶構(gòu)建載體正確性驗(yàn)證
        3.4 測(cè)序結(jié)果與分析
    4 討論
        4.1 載體的選擇
        4.2 酶切位點(diǎn)及抗生素的使用選擇
        4.3 SWISS建模
第三章 人和人參Cu/Zn-SOD蛋白的表達(dá)純化及活性分析
    1 材料與方法
        1.1 主要溶液的配制
        1.2 主要使用儀器及設(shè)備
    2 方法
        2.1 SOD蛋白的表達(dá)
            2.1.1 SOD在不同濃度IPTG濃度下的表達(dá)情況
            2.1.2 SOD在不同誘導(dǎo)時(shí)間下的表達(dá)情況
            2.1.3 SOD在不同溫度下的表達(dá)情況
        2.2 蛋白純化
            2.2.1 Superdex 75 10/300 GL純化
            2.2.2 Hitrap DEAE FF純化
        2.3 蛋白濃度的測(cè)定
        2.4 SOD蛋白的活性測(cè)定
        2.5 不同PH對(duì)兩種酶活性的影響
        2.6 不同溫度對(duì)兩種酶活性的影響
    3 結(jié)果與分析
        3.1 SOD表達(dá)結(jié)果
        3.2 SOD時(shí)間梯度誘導(dǎo)結(jié)果
        3.3 SOD溫度梯度誘導(dǎo)結(jié)果
        3.4 SOD IPTG濃度梯度誘導(dǎo)結(jié)果
        3.5 SOD純化結(jié)果
        3.6 SOD濃度的測(cè)定
        3.7 SOD活性鑒定結(jié)果
        3.8 溫度對(duì)SOD活性的影響
        3.9 PH對(duì)SOD活性的影響
    4 討論
        4.1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2 蛋白純化及活性測(cè)定
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]經(jīng)皮吸收制劑的研究進(jìn)展[J]. 譚紋,楊建龍,雷雪,高鑫,李慶玲.  中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育. 2013(18)
[2]超氧化物歧化酶在疾病檢測(cè)中的臨床價(jià)值[J]. 袁秀梅,齊發(fā)梅,司玉春,張哲梅,王愛霞,賈彥娟.  國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2013(10)
[3]超氧化物歧化酶的生物學(xué)效應(yīng)和在血管性疾病中的作用[J]. 陳珊,程熠,劉全.  中國老年學(xué)雜志. 2013(04)
[4]人參水溶性蛋白的提取及SOD活性測(cè)定[J]. 姚剛,劉宏,歐陽昌漢.  時(shí)珍國醫(yī)國藥. 2012(05)
[5]玉米超氧化物歧化酶的提取與純化工藝[J]. 劉杰鳳,張峰培,杜麗明.  食品研究與開發(fā). 2012(05)
[6]人參中化學(xué)成分分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 李青,方赤光,劉思潔,曹志強(qiáng).  人參研究. 2011(03)
[7]畢赤酵母表達(dá)重組人源Cu/Zn SOD的分離純化與穩(wěn)定性表征[J]. 楊志強(qiáng),張晨,敖偉,蔡澤恩,劉樹滔,饒平凡.  中國食品學(xué)報(bào). 2011(05)
[8]重組人SOD工程菌發(fā)酵表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 劉建榮,宋蒼蒼.  中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 2011(07)
[9]鴨血提取SOD工藝優(yōu)化[J]. 夏駿,毛俞碩,蘇日嘎.  硅谷. 2011(03)
[10]超氧化物歧化酶對(duì)大鼠根尖周炎的作用效應(yīng)[J]. 王青山,舒靜媛,張燕,王晶.  生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志. 2010(05)

博士論文
[1]人參鹿茸中蛋白多肽的純化及活性研究[D]. 嚴(yán)銘銘.長春中醫(yī)藥大學(xué) 2007
[2]植物內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及體外表達(dá)酶活性分析[D]. 尚玉磊.浙江大學(xué) 2004

碩士論文
[1]SOD檢測(cè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病診斷中的意義及青蒿琥酯干擾作用機(jī)制探討[D]. 鐘敏.南方醫(yī)科大學(xué) 2009
[2]人CuZn-SOD突變基因在聚球藻中的高效表達(dá)及活性研究[D]. 高淑彬.廈門大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3599081