牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV）,主要引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病,主要表現(xiàn)出高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥,給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。牛傳染性鼻氣管炎在歐洲流行迅速很難控制。本試驗(yàn)的主要目的是以牛傳染性鼻氣管炎ge基因的原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原建立IBRV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。通過用生物軟件設(shè)計(jì)出IBRV gE基因引物序列,隨后用PCR擴(kuò)增基因,并構(gòu)建了 Pcold-TF-gE原核表達(dá)體系。對(duì)重組蛋白gE誘導(dǎo)表達(dá),以上清形式存在。經(jīng)Westen blot檢測(cè)證明重組表達(dá)產(chǎn)物能被IBRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清特異識(shí)別。以純化鑒定成功的表達(dá)產(chǎn)物為抗原以1μg/mL包被酶標(biāo)板,以HRP兔抗牛為二抗,TMB顯色時(shí)間為15min。結(jié)果顯示:其臨界值為0.369,特異性試驗(yàn)表明:該方法與口蹄疫、牛病毒性腹瀉、副結(jié)核、布氏桿菌、支原體等陽性血清均無交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明:牛陽性血清稀釋比例均達(dá)到1:4096表明具有很好的敏感性。通過對(duì)5份IBRV陽性血清進(jìn)行板間和板內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。利用建立的gE-ELI... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：43 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖４?ｇＥ基因ＰＣＲ產(chǎn)物擴(kuò)増結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｇＥ?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??

１４?牛傳染性鼻氣管炎病毒ｇＥ蛋白原核表達(dá)及間接ＥＬ?ＩＳＡ檢測(cè)方法的建立???２．３．２重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果??用聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)法對(duì)鑒定成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定得到兩個(gè)條??帶分別是５０００ｂｐ和５００ｂｐ的片段。如圖５及圖６所示：??Ｍ?１??％ｚｔ??圖５?ｇＥ重組質(zhì)粒雙酶切鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?５?Ｄｏｕｂｌｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇＥ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：?Ｐｃｏｌｄ－ＴＦ－ｇＥ??Ｍ：?Ｔｒａｎｓ５Ｋ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?Ｐｃｏｌｄ－ＴＦ－ｇＥ??＾Ｄｏ?ｗｎｌｏａｄ?ＧｒｇＤ＾ｉｃ＜??Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ＩＤ：?Ｑｕｅ＾＿１２５９５Ｓ?Ｌｅｎｇｌｆｓ；?１２５７?ｆｉｕｍｂｅｒ?ｏｆ?Ｍａｔｃｈｅｓ：?１??Ｒｏｆｉｇｅ?１：?３６４?ｔｏ?８５７?Ｇｒａｐｈｒｃｓ??（ｉ?ｓ?＾ｘｐｅｃｉ?Ｉｄｅｕｔｉｔｉｅｓ?Ｇａｐｔ?５ｔ？?ｒ，？）ｄ??９１３?ｂｉｔｓ（４９４）?０．０?＾４＾９＾１００°，：］?０：４９－ｖＪ－ｃｊ?Ｐｌｕｓ＾Ｍｍｕｓ??Ｑｕｅｒｙ?１?ＡＣＣＣＣＧＯＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＣＧＧＴａＴＣＡＣＧ＾ＧＣＧＣＧＣＴＧ＾ＳＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＴＴＴ?６０??Ｑｕｅｒｙ?６１?ＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＣ３ＣＧ＜５ＣＴＧＧＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣｔ?１２０??Ｑｕｅｒｙ?１２１?ＧＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣ＾ＡＧＣＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＯＣＧＡＧＴＧＧＴＴＣ

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文?＾５??圖６?ｇＥ基因序列ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｌａｓｔ結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?６?ｇＥ?ｇｅｎｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｌａｓｔ?ｒｅｓｕｌｔｓ??Ｑｕｅｒｙ：?ｇＥ?基因序列?Ｓｂｊｃｔ：?ｇｅｎＢａｎｋ：?１２５９５９??２．３．３重組蛋白最佳誘導(dǎo)濃度的確定??經(jīng)檢測(cè)當(dāng)?ＩＰＴＧ?濃度為?０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ｌｍｍｏｌ／Ｌ?時(shí)，電泳顯示?ｌｍｍｏｌ／Ｌ??濃度時(shí)條帶明顯是７０ＫＤａ，而對(duì)照處無條帶。如圖７所示：??Ｗｉｌｌ??圖７重組蛋白不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)??Ｆｉｇｕｒｅ?７?Ｉｎｄｕｃｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｑｕａｌｉｔｙ?ｓｔａｎｄａｒｄｓ；?ｌ－４Ｉｎｄｕｃｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｍｅ：?１?：??Ｐｃｏｌｄ＇ＴＦ／Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｉｎｄｕｃｅｄ?ｗｉｔｈＩＰＴＧ，?２?：?０．６ｍｍｏｌ／Ｌ，?３：?０．８ｍｍｏｌ／Ｌ，?４：?ｌｍｍｏｌ／Ｌ??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛傳染性鼻氣管炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 任亞初,楚會(huì)萌,程凱慧,解曉莉,張亮,孫陽陽,楊美,楊宏軍,唐月新,劉文浩,李開榮.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(10)
[2]牛傳染性鼻氣管炎病毒部分gB蛋白的原核表達(dá)及抗原性分析[J]. 何小麗,李凡飛,王文佳,張凱,程成,許立華.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2019(17)
[3]牛傳染性鼻氣管炎的診治[J]. 姜強(qiáng).  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2019(06)
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[5]牛皰疹病毒1型感染性疾病的分析診斷和治療控制措施[J]. 李喆.  飼料博覽. 2019(05)
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[10]牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因截短表達(dá)及其抗血清制備[J]. 張輝,宋玲玲,楊宏軍,王洪梅,武建明,候佩莉,何洪彬,王立群.  家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2013(01)

博士論文
[1]IBR間接ELISA的建立及重組gE糖蛋白與單抗的研制[D]. 王海燕.吉林大學(xué) 2006

碩士論文
[1]牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因的截短表達(dá)與間接ELISA診斷方法的建立[D]. 宋林.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立[D]. 周躍輝.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
[3]牛傳染性鼻氣管炎TK/gE基因缺失重組病毒的研究[D]. 定明.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[4]IBRV截短gB基因的表達(dá)及ELISA診斷方法的建立[D]. 李偉.吉林大學(xué) 2009
[5]牛皰疹病毒Ⅰ型重組抗原的制備及間接ELISA方法的建立[D]. 吳春濤.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[6]牛傳染性鼻氣管炎病毒gB蛋白的分段表達(dá)與間接ELISA診斷方法的建立及應(yīng)用[D]. 李兆利.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2006



本文編號(hào)：3598673