艱難梭菌（Clostridium difficile,CD）,作為人腸道常駐菌,是引起抗生素相關(guān)性腹瀉的主要病原菌,也是院內(nèi)腹瀉的主要致病菌。CDI診斷一般采用兩步法,首先針對(duì)產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株均有穩(wěn)定表達(dá)的膜蛋白—谷氨酸脫氫酶（GDH）采用ELISA進(jìn)行初篩,陽(yáng)性病例再進(jìn)行細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)進(jìn)行毒素檢測(cè)。國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)針對(duì)CDI的系統(tǒng)的流行病調(diào)查報(bào)告,也沒(méi)有批準(zhǔn)的商品化檢測(cè)試劑盒。本實(shí)驗(yàn)擬建立針對(duì)GDH的膠體金免疫層析檢測(cè)方法,為CDI的臨床檢測(cè)、流行病調(diào)查,提供一種新的、高特異性檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)以CD630菌株的全基因組序列為模板,PCR方法克隆GDH完整序列,構(gòu)建pET30a（GDH）表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E coli BL21表達(dá)菌株,原核表達(dá)谷氨酸脫氫酶（GDH）,并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。成功表達(dá)后,采用Ni-NTA親和層析法進(jìn)行純化,并以純化后蛋白為抗原,免疫家兔制備多克隆抗體。隨后,以純化的GDH—多克隆抗體為免疫金抗體,GDH—單克隆抗體為檢測(cè)線包被抗體,建立艱難梭菌—GDH膠體金免疫層析檢測(cè)方法。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng),高效表達(dá)GDH蛋白,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析,表達(dá)的GDH大小約51k... 

【文章來(lái)源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁(yè)數(shù)】：94 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)因素Fig.1-1RiskfactorsofCDI（SeekatzAM,2014）

圖 1-2 艱難梭菌孢子萌發(fā)與毒素蛋白致病機(jī)制Fig.1-2 Spore germination and pathogenesis mechanism of CD（SeekatzAM, 20142 腸道微生物的破壞與 CDI 風(fēng)險(xiǎn)因素難梭菌的主要致病因素是腸道微生物菌群的破壞，健康狀態(tài)下的腸道微防止病原微生物定植，稱為定植抗性（colonization resistance）[54]。一定的微生物群落能夠抑制病原體定植，并且相關(guān)研究已經(jīng)提出了多種機(jī)菌群失調(diào)導(dǎo)致定制抗性的缺失，包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)（competition for nutrients競(jìng)爭(zhēng)（ecological competition），群落排斥（niche exclusion）[55]。雖然關(guān)的許多因素都可能導(dǎo)致微生物群落的破壞，但最常見(jiàn)的相關(guān)因素是抗用。Dethlefsen 等人發(fā)現(xiàn)，患者在口服環(huán)丙沙星并停藥之后，雖然腸道進(jìn)行重建，但是其組分和服藥之前并不相同[56]。而與 CDI 感染風(fēng)險(xiǎn)的

cdt E、cdt D 對(duì)毒素 A 和毒素 B 起到正向調(diào)節(jié)作用（圖1-3）。在早期的相關(guān)研究中，以 TcdA 為針對(duì)對(duì)象較多（2003 以前），前文提到毒素 A 是一種腸毒素，其毒素作用主要針對(duì)腸道上皮組織。毒素 A 對(duì)白細(xì)胞有明顯的趨化作用，其受體主要分布于腸粘膜刷狀緣細(xì)胞上（Fig.1-2），與受體結(jié)合后改變肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而進(jìn)一步引發(fā)組織炎性反應(yīng)，動(dòng)物病理模型以腸粘膜上皮水腫、滲出為主[73.74]：Tcd B 以細(xì)胞毒性為主，目前研究者們認(rèn)為毒素 B的致病機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，毒素 B 首先與細(xì)胞表面受體結(jié)合

【參考文獻(xiàn)】：
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