首例體細(xì)胞核移植克隆豬雖已誕生多年,但核移植效率仍然很低。體細(xì)胞核移植多采用體外成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞去核后作為受體卵。但由于豬卵母細(xì)胞體外成熟體系還不夠完善,所以仍需進(jìn)一步優(yōu)化。同時,重構(gòu)胚胎的不完全重編程會導(dǎo)致附植前胚胎不能正常發(fā)育。即使極少數(shù)胚胎能夠發(fā)育存活并誕下后代,后代也常伴有不同程度的發(fā)育缺陷或表型異常。相比著床前的胚胎和克隆動物胎兒,目前對表型異常的克隆豬的甲基化模式研究仍然較少,其分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。本文擬通過在卵母細(xì)胞成熟液中添加紅景天多糖（rhodiola sachalinensis polysaccaride,RSP）來獲得高質(zhì)量的體外成熟卵母細(xì)胞,同時嘗試應(yīng)用新型甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG108來糾正附植前胚胎的異常甲基化修飾狀態(tài),以提高核移植效率。本實驗室在隨后的克隆豬的生產(chǎn)中一共誕下了4頭克隆豬,其中一頭出生后不久死亡,另有2頭克隆豬發(fā)生隱睪。針對這兩頭隱睪克隆豬,我們研究了其睪丸發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)及其甲基化的變化。主要研究結(jié)果如下：（1）在豬卵母細(xì)胞成熟液中添加0.6、6和60mg·L-1的RSP,以第一極體作為核成熟的標(biāo)志,計算卵母細(xì)胞核成熟率；統(tǒng)計體外受精... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬體細(xì)胞核移植研究進(jìn)展
        1.1 體細(xì)胞核移植研究進(jìn)展
        1.2 克隆豬的研究進(jìn)展
            1.2.1 豬體細(xì)胞核移植的主要影響因素
            1.2.2 體細(xì)胞核移植的應(yīng)用前景
    第二章 體細(xì)胞核移植與表觀遺傳學(xué)修飾
        2.1 DNA甲基化
        2.2 組蛋白乙�；�
        2.3 基因組印記
        2.4 X染色體失活
    第三章 DNA甲基化生物學(xué)功能及甲基化檢測方法
        3.1 DNA甲基化生物學(xué)功能
            3.1.1 DNA甲基化與基因表達(dá)
            3.1.2 DNA甲基化與胚胎發(fā)育
            3.1.3 DNA甲基化與X染色體失活
            3.1.4 DNA甲基化與基因印記
            3.1.5 DNA甲基化與腫瘤
            3.1.6 DNA甲基化的其他生物學(xué)功能
            3.1.7 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制干預(yù)DNA甲基化
        3.2 DNA甲基化的檢測方法
第二部分 試驗部分
    第四章 紅景天多糖對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響
        4.1 材料與方法
            4.1.1 材料
            4.1.2 方法
        4.2 結(jié)果與分析
            4.2.1 成熟液中添加RSP對核成熟率的影響
            4.2.2 成熟液中添加RSP對成熟卵母細(xì)胞中GSH濃度和ROS水平的影響
            4.2.3 成熟液中添加RSP對體外受精后胚胎發(fā)育的影響
            4.2.4 成熟液中添加RSP對體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響
        4.3 討論
        4.4 本章小結(jié)
    第五章 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑對供體細(xì)胞的影響
        5.1 材料與方法
            5.1.1 材料
            5.1.2 方法
        5.2 結(jié)果
            5.2.1 HPLC檢測RG108對PFF基因組DNA甲基化水平的影響
            5.2.2 RG108處理對PFF印記基因甲基化水平的影響
            5.2.3 RG108處理PFF對細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡的影響
            5.2.4 RG108處理PFF對細(xì)胞染色體數(shù)的影響
        5.3 討論
        5.4 本章小結(jié)
    第六章 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑核移植胚胎發(fā)育的影響
        6.1 材料與方法
            6.1.1 材料
            6.1.2 方法
        6.2 結(jié)果與分析
            6.2.1 RG108處理供體細(xì)胞對核移植效率的影響
            6.2.2 RG108處理早期重構(gòu)胚對核移植效率的影響
            6.2.3 RG108同時處理供體細(xì)胞與重構(gòu)胚胎對核移植效率的影響
            6.2.4 免疫熒光染色檢測囊胚DNA甲基化水平
        6.3 討論
        6.4 本章小結(jié)
    第七章 SOX9和INSL3基因在克隆豬隱睪中的表達(dá)及甲基化模式
        7.1 材料與方法
            7.1.1 材料
            7.1.2 方法
        7.2 結(jié)果
            7.2.1 重構(gòu)胚胎的移植
            7.2.2 睪丸組織切片顯微結(jié)構(gòu)
            7.2.3 SOX9和INSL3基因的表達(dá)
            7.2.4 SOX9和INSL3基因的啟動子區(qū)域甲基化模式
        7.3 討論
        7.4 本章小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新性
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄(一)
附錄(二)
附錄(三)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3587991