雞球蟲(chóng)病是由多種艾美爾球蟲(chóng)引起的具有嚴(yán)重危害的寄生蟲(chóng)病,其中以柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（Eimeria tenella）致病力最強(qiáng),每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)球蟲(chóng)進(jìn)行防控,最有效的方法是阻斷其入侵,所以篩選鑒定球蟲(chóng)入侵關(guān)鍵蛋白質(zhì)是闡明球蟲(chóng)致病機(jī)理從而進(jìn)行有效防控的首要任務(wù)。球蟲(chóng)入侵過(guò)程復(fù)雜,許多蛋白質(zhì)如棒狀體蛋白、微線蛋白和表面抗原蛋白等已被證明與球蟲(chóng)入侵相關(guān)。有研究表明分泌蛋白在球蟲(chóng)入侵過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,對(duì)入侵相關(guān)分泌蛋白進(jìn)行研究將有助于篩選鑒定球蟲(chóng)入侵關(guān)鍵蛋白質(zhì),加深對(duì)球蟲(chóng)入侵機(jī)理和球蟲(chóng)-宿主之間互作機(jī)制的了解,并為制備更有效的抗球蟲(chóng)藥物或疫苗提供更多重要參考數(shù)據(jù)。本研究通過(guò)TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)E.tenella體外入侵DF1細(xì)胞的相關(guān)分泌蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)篩選鑒定,并對(duì)2個(gè)E.tenella入侵相關(guān)蛋白質(zhì)SAG14和EF1α進(jìn)行了功能初步分析。本研究主要分為以下四個(gè)部分:1.柔嫩艾美爾球蟲(chóng)體外入侵DF1細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析為對(duì)球蟲(chóng)入侵機(jī)理及球蟲(chóng)-宿主細(xì)胞之間互作機(jī)制進(jìn)行深入研究,篩選鑒定入侵相關(guān)蛋白質(zhì)成為研究重點(diǎn)。本研究以未感染細(xì)胞的子孢子分泌蛋白為對(duì)照,通過(guò)TMT標(biāo)記... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：95 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖2TMT標(biāo)記定蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)路線Fig.2TMTMarkingProteomicsTechnologyRoute2.2.5.2胰酶酶解（1）向分泌蛋白溶液中加入終濃度為5mmol/L的二硫蘇糖醇，56℃還原30min；（2）加入終濃度為11mmol/L的碘代乙酰胺，避光室溫孵育15min；（3）將樣品的尿素濃度稀釋至低于2mol/L，按照1:50質(zhì)量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，37℃過(guò)夜酶解；（4）以1:100的質(zhì)量比例（胰酶:蛋白）加入胰酶，繼續(xù)酶解4h2.2.5.3TMT標(biāo)記胰酶酶解的肽段用StrataXC18（Phenomenex）除鹽后進(jìn)行真空冷凍干燥。以0.5mol/LTEAB溶解肽段，根據(jù)TMT試劑盒操作說(shuō)明標(biāo)記肽段。操作如下：標(biāo)記試劑解凍后用乙腈溶解，與肽段混合后室溫孵育2h，標(biāo)記后的肽段混合后除鹽，真空冷凍干燥。2.2.5.4HPLC分級(jí)肽段用高pH反向HPLC分級(jí)，色譜柱為Agilent300ExtendC18（5μm粒徑，4.6mm內(nèi)徑，250mm長(zhǎng)）。操作如下：肽段分級(jí)梯度為8%~32%乙腈、pH9，1h時(shí)間分離60個(gè)組分，隨后肽段合并為6個(gè)組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)操作。2.2.5.5液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析肽段用液相色譜流動(dòng)相A相（0.1%(v/v)甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC1000

雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)體外入侵宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)分析及入侵相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選鑒定26孢子，接種DF1細(xì)胞，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h；（6）收集培養(yǎng)上清及2次PBS洗滌液，1500r/min離心5min，棄上清，加入PBS重懸子孢子并進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析蛋白免疫抑制子孢子入侵DF1細(xì)胞效率2.2.18動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)2.2.18.1動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)及免疫程序購(gòu)買150只1日齡海藍(lán)褐公雛雞，飼喂于隔離罩中。第一次免疫前稱重，剔除體重差異較大雛雞，剩余雛雞隨機(jī)分為4組，每組30只。4個(gè)組分別標(biāo)號(hào)為：PBS-I組（不免疫不感染組），PBS-II組（不免疫感染組），SAG14蛋白免疫組和EF1α蛋白免疫組（表6）。雛雞第7和14日齡時(shí)，分別將PBS和純化蛋白與弗氏佐劑乳化液對(duì)雛雞頸部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫與二次免疫。雛雞21日齡時(shí)，除PBS-I組外均經(jīng)口接種1×104個(gè)新鮮孢子化卵囊。分別在雛雞21和31日齡時(shí)稱量體重，26日齡時(shí)每組隨機(jī)抓取5只雛雞，觀察盲腸病變并評(píng)定記分，在雛雞21和26日齡時(shí)每組隨機(jī)挑選3只雛雞采血分離血清，收集雛雞26至31日齡糞便統(tǒng)計(jì)卵囊排出量（圖3）。表6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組Table6AnimalExperimentGrouping組別PBS-IPBS-IISAG14蛋白組EF1α蛋白組Numberofbirds30303030Proteins(μg/bird)PBSPBS5050Infection(E.tenella)-+++圖3動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Fig.3Animalexperimentdesignflowchart

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于iTRAQ技術(shù)分析柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染后CEF細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白[J]. 王璐,朱順海,趙其平,黃兵,韓紅玉,劉桂玲,李志行,趙煥之,董輝.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2020(05)
[2]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)侵入相關(guān)抗原研究進(jìn)展[J]. 郭衍冰,曹利利,姚新華,董航,程榮華,苑淑賢.  畜牧與獸醫(yī). 2016(08)
[3]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表達(dá)[J]. 曹利利,姚新華,郭衍冰,王英賀,任科研,魏峰,苑淑賢.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(09)
[4]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)棒狀體頸部蛋白2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在293T細(xì)胞中表達(dá)[J]. 王曄,姜連連,韓紅玉,薛璞,趙其平,董輝,朱順海,舒凡帆,黃兵.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2012(05)
[5]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原SAG7基因的克隆與表達(dá)[J]. 李紅炳.  云南畜牧獸醫(yī). 2011(06)
[6]真核細(xì)胞非經(jīng)典蛋白分泌途徑[J]. 張楠楠,劉欣,孫晶,吳毓,李慶偉.  遺傳. 2009(01)
[7]雞球蟲(chóng)入侵機(jī)理、免疫學(xué)性質(zhì)及基因工程在疫苗研制上的應(yīng)用[J]. 陳靜,丁宏標(biāo),喬宇,韓德強(qiáng).  生物技術(shù)通報(bào). 2007(06)
[8]雞球蟲(chóng)入侵相關(guān)分子的研究進(jìn)展[J]. 韓紅玉,林矯矯,黃兵.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2007(09)
[9]翻譯延伸因子1A的研究進(jìn)展[J]. 周冰,曹誠(chéng),劉傳暄.  生物技術(shù)通訊. 2007(02)

碩士論文
[1]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)外泌體的分離與鑒定及泛素蛋白功能初步研究[D]. 李志行.上海師范大學(xué) 2019
[2]雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆與原核表達(dá)[D]. 許李麗.西南大學(xué) 2013
[3]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原基因sag13和sag14的克隆與原核表達(dá)研究[D]. 陳靜.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2008
[4]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原SAG21和SAG23的免疫原性研究[D]. 廖玉聲.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[5]雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原SAG5和SAG10基因的克隆與表達(dá)及免疫保護(hù)性試驗(yàn)[D]. 麥博.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3586023