發(fā)布時間：2022-01-11 20:07

　　上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）是上皮樣細胞向間充質樣細胞轉變的過程,是一個中間態(tài)的變化,現已被證明在癌癥發(fā)生、組織愈合以及iPS誘導過程中起著十分重要的作用。在iPS誘導過程中,主要發(fā)生的是EMT的逆過程,即成纖維樣細胞-上皮樣細胞的轉化（MET）,在這一過程中,會逐漸失去成纖維的細胞形態(tài),轉變?yōu)檫B接更為緊密的上皮細胞形態(tài),且能表達簡單上皮細胞的特異性標志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作為中間絲蛋白中的簡單上皮蛋白,在癌癥和早期胚胎發(fā)育與著床以及iPS誘導過程MET發(fā)生中起著標志性的作用,因此研究這一基因在胚胎發(fā)育與iPS誘導中的作用,對其在基礎功能上的研究具有重要意義。本研究以實驗室前期構建的pKlrkt打靶載體為基礎載體,分別用PCR的方法從胎牛成纖維細胞基因組中獲得包含有該基因啟動區(qū)的5`同源臂和3`同源臂,以酶切連接的方法將兩個同源臂連在基礎載體的MluI和NheI兩個位點,再對td-Tomato質粒進行BamHI和NotI雙酶切,回收片段與連接好兩個同源臂的pKlrkta載體進行連接,獲得內含... 

【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數】：60 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

EMT相關信號通路，引自DongreA,WeinbergRA[1]

4.1 pTKlrkt 打靶載體構建通過已經設計好的引物，以及適宜的PCR條件下，我們獲得了與預期一致的1240 bp的5`arm，和946 bp的3`arm，如圖1。將這一對同源臂連到pEASY-T1 Cloning vector上，鑒定并測序，Blast結果顯示5`arm和3`arm與GeneBank提供的KRT18序列同源性達到99%，顯示得到了連接正確的PT-5a和PT-3a兩種質粒圖1 同源臂擴增結果 A：5`arm擴增結果；B：3`arm擴增結果（M：1Kb Plus Marker）Figure 1 The amplification results of homology arms A:The PCR results of 5`arm; B: The PCR results of 3`arm（M：1Kb Plus Marker）pTKlrkt打靶載體構建完成后，分別用雙酶切或單酶切以鑒定已連接到pTKlrkt打靶載體中的5`arm、3`arm以及td-Tomato片段的大小及方向。鑒定3`arm時，分別用EcoNI單酶切、BglII和Sfiz雙酶切，電泳后顯示前者酶切片段大小為633bp、4222bp 和5875bp，后者片段大小為1990 bp和5867 bp

連接到pTKlrkt打靶載體中。通過對以上三個外源片段的酶切驗證，我們確定pTKlrkt打靶載體連接成功，并使用DNAMAN繪制質粒圖譜，如圖3。圖23`arm 、5`arm和td-Tomato酶切鑒定結果 A、B：3`arm鑒定結果；C：5`arm鑒定結果；D：td-Tomat鑒定結果（M：1Kb Plus Marker）Figure 2 The restriction enzyme digestion results of 3`arm、5`arm and td-Tomato A、B：Identification resultsof 3`arm; C：The results of 5`arm tests; D：Identification result of td-Tomato (M：1Kb Plus Marker)


本文編號：3583384