發(fā)布時間：2022-01-09 04:36

　　腸球菌屬于乳酸菌,是人和動物腸道及部分食品的重要微生物菌群,它能夠產(chǎn)生稱為腸球菌素的抗菌肽。由于腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素不僅能夠抑制與其相關(guān)的菌群還能夠抑制革蘭氏陽性致病菌和食源致病菌,因此,它們有望應(yīng)用在動物飼料添加劑和天然食品保鮮劑中。本研究擬從我室分離保存的具有益生特性的腸球菌中,進(jìn)一步篩選產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌素菌株,并對其細(xì)菌素抑菌特性研究,為開發(fā)新型微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。通過對屎腸球菌HDRsEfl抑菌譜的測定確定金黃色葡萄球菌作為指示菌。瓊脂覆蓋試驗顯示,11株試驗菌株中有5株菌腸球菌有明顯的抑菌效果,結(jié)合PCR技術(shù)對常見的腸球菌素基因進(jìn)行檢測,最終篩選出兩株產(chǎn)EnterocinL50的腸球菌分別為屎腸球菌Wsg09和糞腸球菌T-12。產(chǎn)細(xì)菌素腸球菌的生長曲線、pH和抑菌圈曲線顯示,菌株生長迅速,產(chǎn)酸,培養(yǎng)30h時細(xì)菌素活性達(dá)到最大。從產(chǎn)細(xì)菌素菌株的野生質(zhì)粒上成功擴(kuò)增到了entL50基因,證明該細(xì)菌素是由質(zhì)粒DNA編碼,并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上,構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD-L50測序分析,與登錄號FJ618564.1的基因序列同源性達(dá)到100%。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了蛋白相關(guān)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 細(xì)菌素的研究進(jìn)展
        1.1.1 細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)及定義
        1.1.2 細(xì)菌素的命名及分類
        1.1.3 細(xì)菌素的分子生物學(xué)特性
        1.1.4 細(xì)菌素的作用機(jī)制
        1.1.5 細(xì)菌素與抗生素的區(qū)別
        1.1.6 細(xì)菌素的應(yīng)用
    1.2 主要腸球菌素的介紹
        1.2.1 Class Ⅰ羊毛硫類腸球菌素—溶細(xì)胞素
        1.2.2 Class Ⅱa片球菌樣腸球菌素—腸球菌素A、P
        1.2.3 Class Ⅱb無前導(dǎo)肽的腸球菌素—腸球菌素L50、Q
        1.2.4 Class Ⅱc線性非片球菌素樣腸球菌素—腸球菌素B
        1.2.5 Class Ⅱd環(huán)狀腸球菌—腸球菌素AS-48
2 本研究的目的意義
3 材料與方法
    3.1 試驗材料
        3.1.1 試驗菌株及載體
        3.1.2 主要試劑溶液的配制
        3.1.3 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 屎腸球菌HDRsEf1發(fā)酵液上清抑菌譜的試驗
        3.2.2 腸球菌屬菌體抑菌試驗
        3.2.3 腸球菌素基因PCR的檢測
        3.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的表型鑒定
        3.2.5 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的生長動力學(xué)測定
        3.2.6 細(xì)菌素基因位置的確定
        3.2.7 entL50基因片段的克隆
        3.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.9 表達(dá)載體pET28a-L50A和pET28a-L50B的構(gòu)建
        3.2.10 表達(dá)載體pET28a-L50A和pET28a-L50B的鑒定
        3.2.11 Ent.L50在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的融合表達(dá)
        3.2.12 原核表達(dá)融合蛋白的純化
        3.2.13 融合腸球菌素蛋白抑菌活性的研究
4 結(jié)果與分析
    4.1 屎腸球菌HDRsEfl發(fā)酵液上清抑菌譜
    4.2 腸球菌屬菌體抑菌結(jié)果
    4.3 腸球菌素分子生物學(xué)鑒定
        4.3.1 腸球菌腸球菌素的基因檢測
        4.3.2 陽性腸球菌素基因PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果
        4.3.3 產(chǎn)細(xì)菌素菌株抑菌表型鑒定
        4.3.4 產(chǎn)細(xì)菌素菌株生長動力學(xué)曲線
    4.4 產(chǎn)細(xì)菌素菌株野生質(zhì)粒的提取及質(zhì)粒PCR鑒定
    4.5 重組質(zhì)粒pMD-L50的正確構(gòu)建
    4.6 Ent.L50序列特征及其結(jié)構(gòu)蛋白預(yù)測分析
        4.6.1 Ent.L50A和B蛋白理化性質(zhì)分析
        4.6.2 Ent.L50A和B二級結(jié)構(gòu)的模擬
    4.7 重組表達(dá)載體的正確構(gòu)建
    4.8 重組菌誘導(dǎo)后生長曲線
    4.9 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果
        4.9.1 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的表達(dá)
        4.9.2 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B細(xì)胞定位
        4.9.3 融合蛋白His-Ent.L50A、His-Ent.L50B的純化
    4.10 表達(dá)產(chǎn)物的Westen blot鑒定
    4.11 表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性鑒定
        4.11.1 His-Ent.L50抑菌活性及MIC、MBC測定
        4.11.2 His-Ent.L50抑菌譜測定
        4.11.3 His-Ent.L50對常見致病菌生長的影響
5 討論
    5.1 腸球菌的抑菌作用
    5.2 腸球菌素基因的PCR檢測
    5.3 Ent.L50基因序列特征
    5.4 Ent.L50蛋白結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系
    5.5 細(xì)菌素的異源表達(dá)
    5.6 細(xì)菌素抑菌作用
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3577972