Prox1 （prospero-related homeobox protein 1）作為轉錄因子在胚胎發(fā)育過程中起關鍵調控作用。為探究雞（Gallus gallus） Prox1蛋白亞細胞定位及其在雞生長發(fā)育中的基因表達規(guī)律,本研究以前期構建的pCR2.1-Prox1克隆載體為基礎,構建重組真核表達載體pEGFP-C1-Prox1,將其轉染人（Homo sapien）胚胎腎細胞（HEK-293T）,通過Western blot方法檢測重組蛋白的表達,利用倒置熒光顯微鏡觀察重組蛋白的亞細胞定位;采用qRT-PCR技術檢測Prox1基因在雞胚胎期14 d （E14 d）、0日齡（0 d）、7日齡（7 d）和14日齡（14 d） 4個時間點各組織中的表達情況。結果顯示,本研究成功構建了雞Prox1基因的重組真核表達載體pEGFP-C1-Prox1,轉染細胞后重組蛋白EGFP-Prox1成功表達;熒光觀察顯示,EGFP-Prox1重組蛋白主要定位在細胞核。qRT-PCR檢測結果顯示,在不同組織中,Prox1基因在雞E14 d和7 d的胃中表達最高,0和14 d的肺臟中表達最高;在不同時間點的... 

【文章來源】：農業(yè)生物技術學報. 2020,28(08)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

重組真核表達載體p EGFP-C1-Prox1雙酶切鑒定

圖1 重組真核表達載體p EGFP-C1-Prox1雙酶切鑒定對上述雞Prox1基因在不同發(fā)育過程的表達規(guī)律進行分析，從E14 d到14 d階段，Prox1在眼和腦中的表達趨于穩(wěn)定；7 d前，Prox1在心臟中表達穩(wěn)定，之后開始顯著上升，在14 d時達到最高；0 d前在肝臟中表達穩(wěn)定，出殼后開始逐漸增加，在14 d時達到最高；在肺臟中，E14 d最低，14 d時最高，在發(fā)育過程中表達量隨時間的增加而增加；在胃和腿肌中，均在E14 d最高、0 d最低、7 d有較高表達，整體表達趨勢呈現(xiàn)W形態(tài)；在胸肌中，從E14 d到7 d表達增加，之后下降。

在結構上，Prox1蛋白含有homeobox和prospe‐ro結構域，其中prospero結構域可促進DNA上蛋白質的正確排列，并掩蓋同源域內的核輸出信號(Yousef et al.,2005)。除此之外，Prox1的N端部分具有核定位信號和2個核受體盒，可介導Prox1與肝細胞核因子4 (Song et al.,2006)、肝受體同系物1和肝受體同系物類固醇因子1等核受體相互作用(Steffensen et al.,2004)。在功能上，Prox1作為轉錄因子對胚胎發(fā)育過程中的器官發(fā)育至關重要。胚胎發(fā)育早期，外胚層中的Prox1在神經(jīng)管、交感神經(jīng)節(jié)、心肌細胞和淋巴內皮中表達(Rodriguez-Nie‐denführ et al.,2001)，是腦神經(jīng)發(fā)生發(fā)育過程中齒狀回顆粒細胞成熟和成體神經(jīng)發(fā)生過程中維持中間祖細胞所必需(Lavado et al.,2010)。內胚層中，Prox1表達局限于產(chǎn)生哺乳動物胰腺和肝臟的區(qū)域，是肝細胞、膽管和胰腺上皮的標志物(Burke etal.,2002)。胚胎發(fā)育過程中Prox1的缺失，導致胚胎肝臟減小70%、胰腺減小63%、心臟減少30%且發(fā)育異常，肝葉內沒有肝細胞、沒有淋巴管，胚胎在早期死亡(Wigle et al.,2002;Wang et al.,2005;Rise‐bro et al.,2009)。除此之外，Prox1存在的同源結構域能結合DNA并調控其他基因的轉錄。如Prox1與雞βB1晶狀蛋白基因中的啟動子直接相互作用以激活該基因的表達(Chen et al.,2008)。淋巴管內皮細胞中，Prox1直接結合Pdpn (podoplanin)基因的5"調控區(qū)并反式激活其表達(Pan et al.,2014)。本研究將雞Prox1基因插入到p EGFP-C1中，構建真核表達載體p EGFP-C1-Prox1，將其轉染HEK-293T細胞得到成功表達，并且重組蛋白EGFP-Prox1主要定位在細胞核。有研究發(fā)現(xiàn)，雞胚胎發(fā)育4 d,Prox1蛋白在背胰芽和肝臟的細胞核表達；同樣在胚胎14 d的小鼠成肝細胞核中表達(Papoutsi et al.,2007;Dudas et al.,2004)。在比目魚(Paralichthys olivaceus)的骨骼肌中，Prox1蛋白定位于細胞核，橫紋肌中Prox1缺失導致骨骼肌纖維轉變緩慢(Petchey et al.,2014)；在人胚胎發(fā)育到9.5周時，Prox1蛋白在內核視網(wǎng)膜層分化神經(jīng)元的細胞核中被鑒定。從產(chǎn)前發(fā)育第13周到第31周，Prox1蛋白在成人視網(wǎng)膜中的定位與產(chǎn)前發(fā)育后期相同(Markitantova et al.,2014)；袁繼紅等(2013)將構建的豬(Sus scrofa) p EGFP-C1-Prox1重組真核表達載體轉染豬腎PK15細胞，發(fā)現(xiàn)Prox1蛋白同樣定位于細胞核；近期，本課題組對雞Prox1蛋白質序列進行分析，運用核定位信號在線預測軟件發(fā)現(xiàn)，Prox1蛋白氨基端存在2個核定位信號，可能介導其細胞核定位，但是尚需進一步實驗驗證。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3577318