建立一種TaqMan熒光定量PCR檢測方法,用于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）保守結(jié)構(gòu)蛋白P72基因的檢測。參照GenBank登錄的ASFV P72相關(guān)基因序列,設(shè)計(jì)合成1對特異性引物與1個(gè)TaqMan探針,通過對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,建立了快速檢測ASFV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對該方法的靈敏性、特異性與重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,該方法能有效擴(kuò)增1.0×10⁰～1.0×10⁹拷貝/μL ASFV-P72標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;檢測靈敏度為1.0×10⁰拷貝;對豬流行性腹瀉病毒、豬δ冠狀病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等病原不發(fā)生交叉反應(yīng);重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)（CV）小于1%。結(jié)果表明,本試驗(yàn)建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性,可用于臨床樣本中ASFV的檢測,從而更好地對ASF疫情進(jìn)行監(jiān)測和診斷。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

用建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法對1.0×100～1.0×109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量敏感性檢測。結(jié)果顯示最低檢出量為1.0×100拷貝/μL(圖2),即該方法具有極高的靈敏性。2.4 特異性檢測

對建立的TaqMan熒光定量RT-PCR和SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測方法分別進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。以1.0×102,1.0×105,1.0×108拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別作為模板,進(jìn)行3次批內(nèi)與批間熒光定量RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增,同一質(zhì)粒濃度的擴(kuò)增Ct值在批次內(nèi)與批次間都非常穩(wěn)定。計(jì)算批內(nèi)與批間Ct值的CV均小于1%(表2),表明所建立的方法有較好的可重復(fù)性。表2 TaqMan熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 項(xiàng) 目 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度/(拷貝·μL-1) Ct值 CV/% 批內(nèi)重復(fù) 1.0×102 35.15±0.13 0.32 1.0×105 25.74±0.10 0.28 1.0×108 15.82±0.10 0.63 批間重復(fù) 1.0×102 35.37±0.19 0.67 1.0×105 25.24±0.06 0.08 1.0×108 15.23±0.08 0.45

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