CRISPR是一種特殊的DNA序列重復(fù)家族,是細菌和古細菌在進化中形成的一種免疫防御系統(tǒng)。在CRISPR基因座的附近區(qū)域存在著一個被稱為Cas蛋白的家族,它起著對外源核酸切割的功能。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由重復(fù)序列、間隔序列（protospacers）和重復(fù)序列上游的Cas蛋白家族構(gòu)成。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要有I、II、III三種類型,II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其構(gòu)造簡單,備受研究者青睞并將其改造成為對哺乳動物基因組DNA進行靶向修飾的工具,該系統(tǒng)對靶序列的切割只需要二聚體結(jié)構(gòu)的單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）和Cas9蛋白,gRNA通過引導(dǎo)Cas9識別含有PAM（NGG）的靶基因序列,對靶基因DNA進行雙鏈切割,從而為同源重組介導(dǎo)的基因敲除制造可能。肌肉生長抑制素（myostatin MSTN）是一種分泌性多肽,屬于TGF-β超家族成員,具有該家族共有的生物結(jié)構(gòu)。MSTN基因是骨骼肌的負(fù)調(diào)控因子,主要通過調(diào)節(jié)哺乳動物成肌細胞的增殖影響肌肉的生長和發(fā)育。自然狀態(tài)下的生物學(xué)突變以及利用基因敲除技術(shù)敲除MSTN基因的動物的肌肉量會急劇增加,產(chǎn)生雙肌性狀,生活中我們接觸... 

【文章來源】：長江大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：42 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

豬MSTN基因打靶示意圖

圖 2 HRX-2MCS 載體Fig.2 HRX-2MCS vectorHRX-2MCS 載體為實驗室預(yù)留，存量比較少，需轉(zhuǎn)化 DH5a 感受態(tài)細胞進行增然后進行質(zhì)粒提取，具體步驟為：（1）轉(zhuǎn)化：將 HRX-2MCS 載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)。下：① -80 度冰箱內(nèi)取感受態(tài)并立即置于冰水解凍 2-3min。② 取 1ng 左質(zhì)粒加入到解凍好的 100 ul DH5a 感受態(tài)細胞中，用移液槍反復(fù)吹打混勻冰浴 30 min。③ 將上述步驟完成后的混合物置于 42 ℃水浴鍋內(nèi)熱激 90間盡量不要晃動，之后立即置于冰上靜置 2 min，期間盡量不要晃動。④物內(nèi)加入 800ul 未添加抗生素的 LB 培養(yǎng)基，37℃，220r/min 搖床內(nèi)培養(yǎng) 30⑤ 待 EP 管內(nèi)有乳白色渾濁沉淀出現(xiàn)時取 20-50ul 菌液在無菌操作臺內(nèi)涂抗性的平板上，放于 37℃衡溫培養(yǎng)箱內(nèi)正置 20min 后，反置培養(yǎng)過夜。（2）陽性單克隆菌落挑選及培養(yǎng)：過夜培養(yǎng)后，平板上出現(xiàn)許多單克用無菌鑷子挑取長勢較好，邊緣光滑的單克隆菌置于 5ml 添加氨芐抗性的

圖 3 基因打靶檢測示意圖Fig.3 Detection diagram of gene targeting表 1 引物序列Table 1 primers used in the studyPrimer name Primer sequence(5’-3’) Size(bC1LfC1LrC2LfC2LrC1RfC1RrC2RfC2RrT1-UPGAGGAAAAAGACATTTCAACGGAAAAAGAGGGGCTGTGCCTAGTGAATGGAGGAAGGCTAACTGTGGATTTTGAAGCTGGAGACAAAACACTAAATCTCCAGGCAGGCACATGCTTAAATGGGACTGGATTATTGCGCAATGGTTGGCATTTAACCCTGGAAATCTGAGGCAAACTGC201819202021182022

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3568037