發(fā)布時間：2022-01-03 01:30

　　牛病毒性腹瀉病毒（bovineviraldiarrheaviruses，BVDV）是牛病毒性腹瀉-粘膜病的主要抗原，該病在世界各國都有比較普遍的發(fā)生和存在。該病對我國養(yǎng)殖業(yè)同樣構成嚴重危脅。因此，國內、外對BVD的防治都非常關注。但是目前針對BVDV感染尚無特異性的預防疫苗、治療方法和抗病毒藥物。因此建立新的抗病毒方法，控制病毒的擴散具有重要意義。利用轉基因技術進行抗病育種已成為研究熱點，而抗病候選基因的克隆和驗證是轉基因新品種培育中急待解決的關鍵問題。本研究從兩個角度開展抗BVDV功能基因研究：（1）靶向病毒基因設計siRNA，抑制BVDV增殖為目的，將RNAi技術與轉基因技術相結合，進行抗病毒功能基因研究，并在綿羊個體進行抗BVDV效果評價，為制備抗BVDV轉基因家畜動物奠定基礎；（2）以修飾宿主抗BVDV功能基因，提高BVDV易感動物的抗病性能為目的，通過microRNAs（miRNAs）的差異表達分析，篩選宿主抗BVDV功能基因，為我國抗病轉基因新品種培育和產業(yè)化提供基因資源。首先，設計靶向BVD病毒Npro、C、NS3、NS4B、NS5A基因的shRNA干擾片段，構建相應的s... 

【文章來源】：石河子大學新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：157 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
主要縮略詞
引言
第一章 文獻綜述
    綜述一 牛病毒性腹瀉病毒的研究進展
        1、BVDV概況
        2、BVDV基因組結構及功能
        3、BVDV的持續(xù)感染
    綜述二 轉基因動物的研究進展
        1、轉基因動物制作方法
        2、轉基因動物的應用前景
        3、轉基因動物研究中存在的問題
    綜述三 RNA干擾及其在抗病毒中的應用
        1、RNAI分子機制
        2、RNAI與MIRNA
        3、RNAI與抗病毒研究
第二章 實驗研究
    實驗一 高效抑制BVDV復制SHRNA干擾片段的設計及篩選
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒和細胞
            1.2 載體和菌株
            1.3 限制性內切酶、工具酶及試劑盒
        2 方法
            2.1 靶向BVDVshRNA片段的設計及合成
            2.2 靶向BVDVshRNA干擾載體的構建
            2.3 shRNA干擾載體轉染MDBK細胞
            2.4 細胞攻毒
            2.5 熒光定量PCR檢測BVDVmRNA的表達
            2.6 病毒TCID50檢測
        3 結果
            3.1 靶向BVDVshRNA干擾載體的構建
            3.2 shRNA干擾載體對病毒接種后細胞病變情況的影響
            3.3 熒光定量PCR檢測shRNA干擾載體的抗病毒效果
            3.4 TCID50檢測shRNA干擾載體的抗病毒效果
        4 討論
            4.1 RNAi片段的選擇
            4.2 雙干擾片段的設計
            4.3 細胞水平抗BVDV效果評價
        5 小結
    實驗二 抗BVDV轉基因陽性綿羊胎兒成纖維細胞的制備
        摘要
        1 材料
            1.1 菌種及質粒
            1.2 限制性內切酶和工具酶
        2 方法
            2.1 轉基因表達載體的構建
            2.2 綿羊胎兒成纖維細胞的分離
            2.3 靶向BVDV轉基因表達載體pNeo-2loxp-u6-shBVDV線性化
            2.4 G-418綿羊胎兒成纖維細胞最佳篩選濃度的測定
            2.5 線性化的pNeo-2loxp-u6-shBVDV轉染綿羊胚胎成纖維細胞
            2.6 細胞的篩選
            2.7 陽性細胞的鑒定
        3 結果
            3.1 轉基因載體pNeo-2loxp-u6-shBVDV鑒定
            3.2 綿羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)
            3.3 轉基因陽性細胞的獲得
            3.4 陽性細胞抗病毒效果分析
        4 討論
            4.1 綿羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)
            4.2 細胞轉染和穩(wěn)定篩選
            4.3 轉基因綿羊胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定
            4.4 轉基因細胞對BVDV復制的抑制作用
        5 小結
    實驗三 抗BVDV轉基因綿羊抗病毒效果評價
        摘要
        1 材料
            1.1 實驗動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設備
        2 方法
            2.1 體細胞核移植
            2.2 胚胎移植
            2.3 妊娠診斷
            2.4 轉基因綿羊外源基因整合鑒定
            2.5 shRNA在轉基因綿羊中的表達分析
            2.6 細胞水平抗BVDV能力檢測
        3 結果
            3.1 綿羊卵母細胞的成熟培養(yǎng)
            3.2 重構胚胎的體外發(fā)育
            3.3 靶向抑制BVDV復制轉基因綿羊的研究
            3.4 轉基因綿羊PCR鑒定
            3.5 shRNA在轉基因綿羊中的表達分析
            3.6 流產胎兒成纖維細胞、腎上皮細胞的分離培養(yǎng)及細胞水平抗BVDV能力檢測
        4 討論
            4.1 shRNA轉基因綿羊的制備
            4.2 轉基因動物流產及克隆效率低
            4.3 轉基因綿羊體細胞抗BVDV感染能力的初步評價
        5 小結
    實驗四 MIR-1249在MDBK細胞中的抗BVDV研究
        摘要
        1 材料
            1.1 細胞、病毒
            1.2 主要試劑
        2 方法
            2.1 總體技術路線
            2.2 測序樣品準備
            2.3 高通量測序
            2.4 凋亡相關microRNA預測及分析
            2.5 microrRNA的驗證
            2.6 miR-1249功能分析(凋亡檢測)
            2.7 miR-1249靶點驗證
        3 結果
            3.1 建立病毒感染miRNA表達譜
            3.2 差異表達miRNAs篩選及鑒定
            3.3 miR-1249表達驗證
            3.4 miR-1249功能研究
            3.5 miR-1249靶基因研究
        4 討論
            4.1 miR-1249功能研究
            4.2 miR-1249作用靶點分析
            4.3 Bcl-2蛋白表達量分析
            4.4 miR-1249靶基因調節(jié)細胞凋亡的分子機制
            4.5 抗BVDV轉基因綿羊抗病育種新思路
        5 小結
第三章 全文結論與創(chuàng)新點
    全文結論
    創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
    附件（一） 實驗一技術路線
    附件（二） 實驗二技術路線
    附件（三） 實驗三技術路線
    附件（四） 實驗四技術路線
致謝
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本文編號：3565289