利用牛乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)生乳糖分解酶從而生產(chǎn)低乳糖牛奶，是解決乳糖不耐癥的一種手段，而構(gòu)建高效、特異的表達載體是制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵步驟。本實驗將來源于古細菌的嗜熱菌β-糖苷酶基因（LacS）根據(jù)牛的密碼子使用頻率進行了密碼子優(yōu)化，并合成了優(yōu)化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游調(diào)控區(qū)域做為啟動子，以嗜熱菌β-糖苷酶（LacS）為目的基因，添加了Loxp錨定的新霉素抗性基因（Neo）和增強型綠色熒光蛋白報告基因（EGFP），構(gòu)建了pLOX-EGFP-BLG-LacS載體。并且通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠的乳腺癌細胞，并篩選得到單克隆。陽性單克隆通過PCR進行DNA水平的整合檢測；經(jīng)催乳素誘導(dǎo)后的陽性單克隆通過RT-PCR進行mRNA水平表達檢測。研究結(jié)果如下：首先,乳腺特異表達載體的構(gòu)建。通過PCR技術(shù)擴增出924bp牛β-乳球蛋白（BLG）基因5′調(diào)控序列，并與T載體連接記為pMD-19BLG，質(zhì)粒大小為3.7kb。然后將其與公司優(yōu)化合成的pUC57-LacS質(zhì)粒，pLOX-EGFP質(zhì)粒通過相應(yīng)的酶切后進行連接，經(jīng)基因重組后構(gòu)建了乳腺特異性表達載體pLOX-EGFP-BLG... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

硫礦硫化葉菌與�；蚪M的氨基酸密碼子使用百分比統(tǒng)計

圖 1 硫礦硫化葉菌與牛基因組的氨基酸密碼子使用百分比統(tǒng)計Fig.1 Codon usage frequency of sulfolobus solfataricus and bovine genome為硫礦硫化葉菌的密碼子使用百分比，黑色為牛的密碼子使用百分比。

在生工生物工程(上海)有限公司進行了優(yōu)化后的 LacS基因以及 SV40加尾序基因合成（GN:0696），用于載體構(gòu)建。合成序列結(jié)果如下：圖 3 LacS 密碼子優(yōu)化改變堿基圖Fig.3 Codon optimization results of LacS gene

【參考文獻】：
期刊論文
[1]糖苷酶的特性與應(yīng)用[J]. 馬歌麗,魏泉增.  食品科技. 2008(07)
[2]轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良家畜的現(xiàn)狀與趨勢[J]. 童佳,李寧.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報. 2007(04)
[3]轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器研究進展[J]. 朱小甫,渠敬峰,吳旭錦,樊松濤,馬秋明,高睿.  畜牧獸醫(yī)雜志. 2007(03)
[4]動物乳腺生物反應(yīng)器的研發(fā)及應(yīng)用[J]. 張莉,楊靜利.  生物學(xué)通報. 2007(04)
[5]用牛αS1-酪蛋白基因構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器表達載體的研究[J]. 管曉斌,李春笑,賴松家.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(23)
[6]轉(zhuǎn)基因技術(shù)在制備動物乳腺生物反應(yīng)器中的應(yīng)用和發(fā)展[J]. 熊繼紅,江黎明.  生物技術(shù)通訊. 2006(04)
[7]乳腺生物反應(yīng)器特異調(diào)控序列的構(gòu)建[J]. 蔣小玲,張紅梅,徐六妹,王火生,樂曉華,李麗雄,周伯平.  中國生物制品學(xué)雜志. 2006(03)
[8]動物乳腺生物反應(yīng)器研究進展[J]. 袁建民,胡建宏,李青旺,賈永紅,王立強.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2006(03)
[9]轉(zhuǎn)人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反應(yīng)器的建立[J]. 嚴華,李國才,孫懷昌.  中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志. 2005(05)
[10]轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器研究概況[J]. 李娜,王欽德.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2005(04)

博士論文
[1]人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器的研制[D]. 劉思國.華東師范大學(xué) 2006



本文編號：3565019