近年來,我國水禽的呼腸孤病毒感染不斷發(fā)生,并逐漸呈流行趨勢,嚴(yán)重影響了水禽業(yè)的健康發(fā)展。1997年我國番鴨出現(xiàn)以軟腳、腹瀉、肝白色壞死為主要特征的番鴨肝白點(diǎn)病,2005年出現(xiàn)以心：脾、肝、法氏囊等多器官出血／壞死為主要特征的鴨壞死性肝炎,證明其其病原均為禽呼腸孤病毒（Avianreo virus, ARV）。研究表明,禽呼腸孤病毒感染無論從流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化,以及病毒生物學(xué)特性、基因組片段特征和序列同源性等方面均發(fā)生了變化。本實(shí)驗(yàn)室從太湖發(fā)病鴨廠的病鴨組織中分離了一株病毒,經(jīng)證明其為新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）,將該病毒命名為新型鴨呼腸孤病毒太湖2011株（NDRV TH11）。σ C蛋白為禽呼腸孤病毒的吸附蛋白,能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體,aC蛋白還能夠與呼腸孤病毒競爭性的吸附細(xì)胞,吸附后可阻斷病毒對細(xì)胞的吸附,所以以aC蛋白制備的基因工程苗具有良好的免疫保護(hù)性。本研究制備了NDRVσC蛋白的兔源多克隆抗體,構(gòu)建重組桿狀病毒BV-σC,并對表達(dá)的aC蛋白進(jìn)行疫原性檢測和動(dòng)物試驗(yàn)。主要研究內(nèi)容如下：1、NDRVσC蛋白的原核表達(dá)及多克... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略表
文獻(xiàn)綜述
1 引言
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 載體、細(xì)胞、病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主試劑與試劑盒
        2.1.3 主要溶液及培養(yǎng)基的配制
        2.1.4 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 NDRV σC蛋白多克隆抗體的制備
            2.2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成
            2.2.1.2 σC基因的擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.1.4 重組蛋白的純化及反應(yīng)原性檢測
            2.2.1.5 多克隆抗體的制備及其效價(jià)測定
            2.2.1.6 多克隆抗體IFA檢測
        2.2.2 σC基因重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
            2.2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成
            2.2.2.2 σC基因的克隆
            2.2.2.3 σC基因的PCR產(chǎn)物的回收純化
            2.2.2.4 σC基因片段和pFastBac~(TM)1質(zhì)粒的雙酶切
            2.2.2.5 σC基因片段和pFastBac~(TM)1的連接
            2.2.2.6 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.2.7 克隆質(zhì)粒的挑選與鑒定
            2.2.2.8 重組質(zhì)粒的提取
            2.2.2.9 重組pF-σC質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.2.2.10 重組pF-σC質(zhì)粒的序列分析鑒定
        2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座(即重組Bacmid的構(gòu)建)
            2.2.3.1 DH10Bac感受態(tài)制作
            2.2.3.2 重組穿梭質(zhì)粒的制備
            2.2.3.3 重組Bacmid DNA的提取及鑒定
        2.2.4 重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞及收獲重組桿狀病毒
            2.2.4.1 重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞
            2.2.4.2 擴(kuò)增P1代病毒原液
            2.2.4.3 噬斑測定病毒滴度
            2.2.4.4 σC在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)
        2.2.5 sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)蛋白的鑒定
            2.2.5.1 SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析
            2.2.5.2 SDS-PAGE蛋白質(zhì)樣品的制備
            2.2.5.3 SDS-PAGE
            2.2.5.4 IFA鑒定
            2.2.5.5 Western blot鑒定
        2.2.6 油乳劑疫苗的制備
        2.2.7 動(dòng)物免疫
        2.2.8 重組桿狀病毒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性評價(jià)
            2.2.8.1 ELISA方法檢測抗體水平
            2.2.8.2 病毒中和抗體檢測結(jié)果
        2.2.9 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 NDRV 6C蛋白多克隆抗體的制備
        3.1.1 σC基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 aC蛋白表達(dá)與純化
        3.1.3 多克隆抗體制備及其效價(jià)檢測
        3.1.4 多克隆抗體的特異性檢測
    3.2 重組載體鑒定結(jié)果
    3.3 重組Bacmid的篩選與鑒定
    3.4 σC蛋白在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)
        3.4.1 重組桿狀病毒的細(xì)胞病變觀察
        3.4.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測
        3.4.3 表達(dá)產(chǎn)物的IFA檢測
        3.4.4 Western-blot檢測
    3.5 重組桿狀病毒在櫻桃谷肉鴨體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性評價(jià)
        3.5.1 ELISA檢測結(jié)果
        3.5.2 病毒中和抗體檢測結(jié)果
    3.6 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3549954