參照GenBank中滑液支原體（Mycoplasma synoviae,MS）WVU1853株dnaK基因序列（CP011096.1）設(shè)計(jì)并合成特異性引物,利用overlap PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得MS dnaK基因,并將其克隆至pMD19-T載體,在序列分析的基礎(chǔ)上將該基因克隆至pET-28a（+）質(zhì)粒,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-dnaK并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDS-PAGE分析。繼而將純化表達(dá)產(chǎn)物免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體,并利用間接ELISA、Western-blot和免疫熒光試驗(yàn)對(duì)MS DnaK的免疫原性及其在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,MS dna K基因全長(zhǎng)1 791 bp,編碼596個(gè)氨基酸,重組蛋白rMSDnaK在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá),且其相對(duì)分子質(zhì)量約為67 ku。間接ELISA和Western-blot結(jié)果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞漿和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量較多,免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)DnaK在MS膜表面的分布。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MS ... 

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滑液支原體dnaK基因的擴(kuò)增Figure1AmplificationofMSdnaKgene500bp250bp100bp

pET-dnaK的雙酶切鑒定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaK250bp

中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)第50卷圖3pET-dnaK的雙酶切鑒定Figure3BamHⅠandXhoⅠendonucleasesdigestioniden-tificationofvectorpET-dnaKM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-dnaK的雙酶切產(chǎn)物。M：DL15000DNAMarker；1：ProductsfrompET-dnaKdigestedwithBamHⅠandXhoⅠ.圖2dnaK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure2PhylogenetictreeofdnaKgene圖1滑液支原體dnaK基因的擴(kuò)增Figure1AmplificationofMSdnaKgeneM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：dnaK基因的PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照。M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductofdnaKgene；2：Negativecontrol.清（1∶200稀釋?zhuān)?7℃孵育2h，PBST洗滌3次，加入100LHRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶8000稀釋?zhuān)㊣gG，37℃孵育1h，PBST洗滌3次后，毎孔加100LTMB顯色液，室溫避光顯色，15min后加終止液終止反應(yīng)，并于450nm處測(cè)定D值。試驗(yàn)設(shè)空白和陰性對(duì)照，重復(fù)3次取平均值。1.11免疫熒光試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MS菌液1.5mL，4℃12000r/min離心10min收集菌體，PBS洗3次后，用200L重懸，取適量涂于蓋玻片上，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，自然風(fēng)干后加固定液固定20min，PBST洗滌3次，置于含5％脫脂乳的培養(yǎng)皿中封閉1h，加入MS重組蛋白DnaK抗血清（1∶1000稀釋?zhuān)?7℃孵育2h，PBST洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200稀釋?zhuān)?7℃避光孵育1h，PBST避光洗滌3次，封片并于熒光顯微鏡下觀察。2結(jié)果2.1MSdnaK基因的擴(kuò)增以MS榆中分離株基因組DNA為模板，利用overlapPCR擴(kuò)增dnaK基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為1791bp（圖1），與預(yù)期片段大小一致。2.2MSdnaK基因的序列分析將測(cè)序獲得的dnaK基因序列與GenBank中部分MSdnaK序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，與MS不同分離株的dnaK基因序列同源性高達(dá)99.4％，而與雞毒支原體、牛支原體之間的

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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