利用CRISPR/Cas9和λ-Red級聯(lián)技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT敲除菌株
發(fā)布時間：2021-12-18 20:45
本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red級聯(lián)的技術(shù)對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88的熱不穩(wěn)定性腸毒素（heat-labile toxin,LT）基因進行無痕敲除并獲得K88 LT-缺陷菌株。通過序列比對獲取LT兩端同源序列,并構(gòu)建包含LT邊界、氯霉素篩選標記、sgRNA和LT同源臂的供體片段;將供體片段轉(zhuǎn)化至ETEC K88,同時分別利用λ-Red同源重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),對LT基因進行敲除;通過PCR驗證獲得了K88 LT-缺陷菌株,并通過試驗測定了敲除菌株的溶血能力和生長曲線。結(jié)果顯示,λ-Red同源重組系統(tǒng)可成功地將LT基因替換為相應(yīng)的供體片段,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可高效地對篩選標記進行刪除,最終通過λ-Red和CRISPR/Cas9結(jié)合的基因編輯系統(tǒng)可成功對ETEC K88的LT基因進行無痕敲除。體外試驗結(jié)果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力喪失,并且生長速度比野生型菌株減緩,LT可能和ETEC...
【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(03)北大核心
【文章頁數(shù)】：10 頁
【部分圖文】：
pCas-Red質(zhì)粒圖譜
通過引物LT-F/LT-R克隆LT基因全長,連接TA-克隆載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。挑選單克隆,將經(jīng)PCR驗證篩選的陽性克隆測序,比對NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得LT基因全長及其上、下游序列。根據(jù)LT基因及其上、下游序列設(shè)計其5′端同源臂序列L-arm short和L-arm,3′端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette為LT的替代基因,合成LT基因的供體LTh donar (L-arm+Cat-chl cassette+L-arm short+R-arm)(圖2)。1.7 LTh donar轉(zhuǎn)化
通過Red系統(tǒng)介導(dǎo)的HR插入Chl抗性基因CmR,用于篩選陽性的毒素基因LT替代克隆(圖3)。制備含pCas-Red質(zhì)粒電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞,接種含pCas-Red質(zhì)粒的ETEC K88陽性克隆子至50 mL含Amp和1%甘油的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 h后,加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)λ-RED蛋白的表達,30 ℃生長至D600 nm值為0.6左右,其他步驟同前。取50 μL含pCas-Red質(zhì)粒的感受態(tài)細胞加入LT donar,轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中混勻進行電轉(zhuǎn),條件同前。細胞在30 ℃復(fù)蘇2 h,涂布于含Amp、氯霉素和1%甘油的LB培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆,通過引物LTh donor-F/R進行PCR驗證LTh donar基因的插入。1.8 LT基因敲除菌株的篩選
【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的蒙古牛MSTN基因敲除細胞系的建立[J]. 郭梓茹,張立,馬云龍,蘇小虎,周歡敏,張焱如,劉曉. 中國畜牧獸醫(yī). 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9的原理及其應(yīng)用進展[J]. 楊佳儒,郭美華,柳愛華,寶福凱. 昆明醫(yī)科大學學報. 2016(05)
[3]利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)及其初步應(yīng)用[J]. 余深翼,趙金榮,鄭玲紅,朱二鵬,周五朵,吳寶成. 畜牧獸醫(yī)學報. 2016(04)
[4]運用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其對脂肪酸代謝的影響[J]. 夏軍,鄭明剛,王玲,孫承君,鄭立,祝建波. 微生物學通報. 2016(08)
[5]腸毒性大腸桿菌gspD基因敲除以及對LT毒素分泌的影響[J]. 魯曦,傅恩清,潘蕾,穆德廣,李王平,金發(fā)光. 基因組學與應(yīng)用生物學. 2015(12)
[6]應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT基因表達的研究[J]. 付瑞,劉華,段勇,王玉明,單斌. 國際檢驗醫(yī)學雜志. 2015(08)
[7]λ-Red重組系統(tǒng)敲除腸出血性大腸桿菌O157:H7細胞毒素stx2基因[J]. 劉變芳,殷先華,呂欣,魏新元,郭藹光. 中國獸醫(yī)學報. 2010(07)
[8]平板免疫溶血法檢測產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素[J]. 楊正時,鐘熙. 醫(yī)學研究通訊. 1987(08)
碩士論文
[1]K88ac+大腸桿菌減毒株的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的初步應(yīng)用[D]. 余樹培.揚州大學 2016
本文編號：3543141
【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(03)北大核心
【文章頁數(shù)】：10 頁
【部分圖文】：
pCas-Red質(zhì)粒圖譜
通過引物LT-F/LT-R克隆LT基因全長,連接TA-克隆載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。挑選單克隆,將經(jīng)PCR驗證篩選的陽性克隆測序,比對NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得LT基因全長及其上、下游序列。根據(jù)LT基因及其上、下游序列設(shè)計其5′端同源臂序列L-arm short和L-arm,3′端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette為LT的替代基因,合成LT基因的供體LTh donar (L-arm+Cat-chl cassette+L-arm short+R-arm)(圖2)。1.7 LTh donar轉(zhuǎn)化
通過Red系統(tǒng)介導(dǎo)的HR插入Chl抗性基因CmR,用于篩選陽性的毒素基因LT替代克隆(圖3)。制備含pCas-Red質(zhì)粒電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞,接種含pCas-Red質(zhì)粒的ETEC K88陽性克隆子至50 mL含Amp和1%甘油的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 h后,加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)λ-RED蛋白的表達,30 ℃生長至D600 nm值為0.6左右,其他步驟同前。取50 μL含pCas-Red質(zhì)粒的感受態(tài)細胞加入LT donar,轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中混勻進行電轉(zhuǎn),條件同前。細胞在30 ℃復(fù)蘇2 h,涂布于含Amp、氯霉素和1%甘油的LB培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆,通過引物LTh donor-F/R進行PCR驗證LTh donar基因的插入。1.8 LT基因敲除菌株的篩選
【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的蒙古牛MSTN基因敲除細胞系的建立[J]. 郭梓茹,張立,馬云龍,蘇小虎,周歡敏,張焱如,劉曉. 中國畜牧獸醫(yī). 2018(04)
[2]CRISPR-Cas9的原理及其應(yīng)用進展[J]. 楊佳儒,郭美華,柳愛華,寶福凱. 昆明醫(yī)科大學學報. 2016(05)
[3]利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)及其初步應(yīng)用[J]. 余深翼,趙金榮,鄭玲紅,朱二鵬,周五朵,吳寶成. 畜牧獸醫(yī)學報. 2016(04)
[4]運用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其對脂肪酸代謝的影響[J]. 夏軍,鄭明剛,王玲,孫承君,鄭立,祝建波. 微生物學通報. 2016(08)
[5]腸毒性大腸桿菌gspD基因敲除以及對LT毒素分泌的影響[J]. 魯曦,傅恩清,潘蕾,穆德廣,李王平,金發(fā)光. 基因組學與應(yīng)用生物學. 2015(12)
[6]應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT基因表達的研究[J]. 付瑞,劉華,段勇,王玉明,單斌. 國際檢驗醫(yī)學雜志. 2015(08)
[7]λ-Red重組系統(tǒng)敲除腸出血性大腸桿菌O157:H7細胞毒素stx2基因[J]. 劉變芳,殷先華,呂欣,魏新元,郭藹光. 中國獸醫(yī)學報. 2010(07)
[8]平板免疫溶血法檢測產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素[J]. 楊正時,鐘熙. 醫(yī)學研究通訊. 1987(08)
碩士論文
[1]K88ac+大腸桿菌減毒株的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的初步應(yīng)用[D]. 余樹培.揚州大學 2016
本文編號：3543141
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/dongwuyixue/3543141.html
最近更新
教材專著
