本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red級(jí)聯(lián)的技術(shù)對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88的熱不穩(wěn)定性腸毒素（heat-labile toxin,LT）基因進(jìn)行無(wú)痕敲除并獲得K88 LT^-缺陷菌株。通過(guò)序列比對(duì)獲取LT兩端同源序列,并構(gòu)建包含LT邊界、氯霉素篩選標(biāo)記、sgRNA和LT同源臂的供體片段;將供體片段轉(zhuǎn)化至ETEC K88,同時(shí)分別利用λ-Red同源重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),對(duì)LT基因進(jìn)行敲除;通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得了K88 LT^-缺陷菌株,并通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定了敲除菌株的溶血能力和生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,λ-Red同源重組系統(tǒng)可成功地將LT基因替換為相應(yīng)的供體片段,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可高效地對(duì)篩選標(biāo)記進(jìn)行刪除,最終通過(guò)λ-Red和CRISPR/Cas9結(jié)合的基因編輯系統(tǒng)可成功對(duì)ETEC K88的LT基因進(jìn)行無(wú)痕敲除。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力喪失,并且生長(zhǎng)速度比野生型菌株減緩,LT可能和ETEC... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2020,47(03)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：10 頁(yè)

【部分圖文】：

pCas-Red質(zhì)粒圖譜

通過(guò)引物L(fēng)T-F/LT-R克隆LT基因全長(zhǎng),連接TA-克隆載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。挑選單克隆,將經(jīng)PCR驗(yàn)證篩選的陽(yáng)性克隆測(cè)序,比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),獲得LT基因全長(zhǎng)及其上、下游序列。根據(jù)LT基因及其上、下游序列設(shè)計(jì)其5′端同源臂序列L-arm short和L-arm,3′端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette為L(zhǎng)T的替代基因,合成LT基因的供體LTh donar (L-arm+Cat-chl cassette+L-arm short+R-arm)(圖2)。1.7 LTh donar轉(zhuǎn)化

通過(guò)Red系統(tǒng)介導(dǎo)的HR插入Chl抗性基因CmR,用于篩選陽(yáng)性的毒素基因LT替代克隆(圖3)。制備含pCas-Red質(zhì)粒電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,接種含pCas-Red質(zhì)粒的ETEC K88陽(yáng)性克隆子至50 mL含Amp和1%甘油的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 h后,加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)λ-RED蛋白的表達(dá),30 ℃生長(zhǎng)至D600 nm值為0.6左右,其他步驟同前。取50 μL含pCas-Red質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞加入LT donar,轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中混勻進(jìn)行電轉(zhuǎn),條件同前。細(xì)胞在30 ℃復(fù)蘇2 h,涂布于含Amp、氯霉素和1%甘油的LB培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆,通過(guò)引物L(fēng)Th donor-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證LTh donar基因的插入。1.8 LT基因敲除菌株的篩選

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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