發(fā)布時間：2021-11-27 09:56

　　小反芻獸疫病毒（PPRV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬,主要感染山羊和綿羊等小反芻動物,具有較高的發(fā)病率和死亡率,世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告的疾病,我國列為I類動物傳染病。近年來小反芻獸疫在我國頻頻發(fā)生,對畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴重威脅,該病主要以免疫預防為主,因此準確檢測免疫抗體對于防控該病非常重要。以篩選的PPRV H蛋白B細胞表位為基礎,選擇反應原性較好的4段抗原表位串聯(lián)后合成作為包被抗原,建立針對H蛋白抗體的iELISA檢測方法,并對相關條件進行優(yōu)化。經優(yōu)化后,多表位抗原肽的最佳包被濃度為1.5ⅹ10^-6μg/孔,待檢血清陰陽性臨界稀釋濃度為1:100,酶標二抗最佳稀釋濃度為1:80000;對反應中各種緩沖液進行篩選:包被液為碳酸鹽緩沖液;血清和二抗稀釋液均為PBST溶液,封閉液為2%BSA溶液;本試驗在陽性對照OD₄₅₀≥0.5、陰性對照OD₄₅₀<0.25的基礎上,血清樣品的判定標準為:OD₄₅₀<?X+2S=0.25為陰性,OD₄₅₀≥?X+3S... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數】：68 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

小反芻獸疫病毒基因組結構

中國農業(yè)科學院碩士學位論文第一章引言3圖1-2小反芻獸疫病毒粒子結構Fig1-2ThestructureofPPRVparticle1.1.2病毒基因編碼的蛋白及其功能1.1.2.1核衣殼（N）蛋白PPRV核衣殼蛋白是病毒進入宿主細胞后最先表達的蛋白，也是病毒最為主要的結構蛋白，其基因全長1577bp，編碼525個氨基酸，蛋白分子量大約為58kDa。小反芻獸疫病毒N蛋白高度保守，其序列與麻疹病毒屬其它成員具有較高的相似性，同源性在75-83%之間，根據這一點將N蛋白分為4個區(qū)段。區(qū)段I位于1-120氨基酸區(qū)段且高度保守；區(qū)段II位于122-145氨基酸區(qū)段，同源性僅40%；區(qū)段III位于146-398氨基酸處，為保守性最高的區(qū)段；區(qū)段IV位于421-525氨基酸處，為保守性最差的區(qū)段(Baileyetal.,2005;A.Diallo,Barrett,Barbron,Meyer,&Lefevre,1994)。相關研究顯示，PPRVN蛋白I區(qū)和II區(qū)相對于III區(qū)和IV區(qū)具有相對較好的免疫原性，這與麻疹病毒成員中麻疹病毒和牛瘟病毒N蛋白相應區(qū)域的免疫原性一樣(Choi,Nah,Ko,Kang,&Joo,2003;N,O,&L,1989)。N蛋白在病毒的生命周期中扮演著重要的作用。在病毒組裝階段，N蛋白可與病毒M蛋白相互作用從而促進病毒的組裝；同時也是病毒基因組RNA形成核衣殼必不可少的成分，在病毒的復制和轉錄過程中參與到P-L聚合酶的形成。通過對病毒N基因進行沉默，可檢測到病毒的復制減少，進一步的研究發(fā)現對N蛋白進行抑制后PPRVM蛋白的表達量減少(ServandeAlmeida,Keita,Libeau,&Albina,2007)，說明病毒N蛋白與病毒的復制密切相關。N蛋白雖然是病毒免疫原性最強且表達量最豐富的蛋白，但該蛋白并不能誘導機體產生免疫保護。由于N蛋白免疫原性最強，所以被廣泛應用于PPRV診斷技術的開發(fā)。1.1.2.2磷酸化（P）蛋白

中國農業(yè)科學院碩士學位論文第一章引言7圖1-3基于H基因的PPRV進化分析(Liangetal.,2016)Fig1-3ThephylogenticanalysisofPPRVbasedonHgene(Z.Liang,Yuan,Chen,Zhu,&Dou,2016)1.1.4PPRV的致病機制1.1.4.1PPRV誘導的細胞凋亡病毒進入細胞后具有阻止細胞凋亡的機制，也有促進細胞凋亡的機制。PPRV的感染周期較長，可達4-7天，病毒進入細胞后利用其抑制細胞凋亡的機制阻止細胞凋亡，從而延長病毒在胞內的持續(xù)增殖；當病毒粒子將要從胞內釋放，病毒即啟動促進細胞凋亡的機制，促進細胞凋亡裂解使病毒釋放持續(xù)感染臨近的細胞。誘導細胞凋亡的同時產生細胞毒性，由此產生致病性。PPRV感染山羊的外周血單淋巴細胞后，誘導的細胞凋亡可以促進病毒在細胞內的復制(Mondal,Sreenivasa,Dhar,Singh,&Bandyopadhyay,2001)。研究發(fā)現麻疹病毒的N蛋白為誘導凋亡的關鍵蛋白(Ashima,Jyoti,Akhil,Pramod,&J.,2011)，N蛋白在麻疹病毒屬成員中相對保守且PPRVN蛋白與MV的N蛋白具有高度相似性，因此可以推測PPRV的N蛋白也可能具有MVN蛋白的相似功能。相關研究表明，PPRV感染后誘導的凋亡與PPRV和免疫系統(tǒng)之間的相互作用有關，雖然其機制尚不清楚，但這一現象已在MV上得到驗證(Schnorr,Seufert,Schlender,Borst,&Schneider-Schaulies,1998)。1.1.4.2PPRV引起的免疫抑制

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Reverse Genetics for Peste des Petits Ruminants Virus: Current Status and Lessons to Learn from Other Non-segmented Negative-Sense RNA Viruses[J]. Alfred Niyokwishimira,Yongxi Dou,Bang Qian,Prajapati Meera,Zhidong Zhang.  Virologica Sinica. 2018(06)
[2]小反芻獸疫病毒H蛋白的表達及間接ELISA方法的建立[J]. 欒志舫,陳妍,吳錦艷,王光祥,田宏,尹雙輝,楊順利,尚佑軍,張志東,劉湘濤.  中國獸醫(yī)學報. 2016(07)
[3]小反芻獸疫的流行動態(tài)及疫苗的研究進展[J]. 趙剛.  現代畜牧獸醫(yī). 2014(03)
[4]小反芻獸疫流行病學及防控研究進展[J]. 龍云鳳,劉曉慧,周曉黎,祝賀,艾軍,董俊,葉玲玲,陳朝銀.  動物醫(yī)學進展. 2012(05)
[5]小反芻獸疫的研究進展[J]. 駱學農,鄭亞東,才學鵬.  中國獸醫(yī)科學. 2007(11)
[6]臨界值標準法應用于酶聯(lián)免疫吸附檢測結果判斷的研究[J]. 梁棉.  現代醫(yī)院. 2005(06)

碩士論文
[1]小反芻獸疫多表位疫苗抗原的設計及其免疫效力評價[D]. 梁忠祥.中國農業(yè)科學院 2017
[2]PPRV DAS-ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測方法的建立[D]. 何紅菊.昆明理工大學 2013



本文編號：3522045