日本腦炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一種重要的人畜共患傳染病,在全世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重的危害,每年造成大約6-8萬(wàn)人感染,大約1.5-2萬(wàn)人死亡。豬-蚊-豬循環(huán)是乙腦傳播的主要方式,豬是中間宿主和擴(kuò)增宿主。乙腦感染豬時(shí)可引起母豬流產(chǎn)、木乃伊胎和公豬睪丸炎等,并在扁桃體中長(zhǎng)期帶毒。豬作為JEV的擴(kuò)增宿主,能夠長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生病毒血癥,是病毒傳播和流行的基礎(chǔ)。但目前豬作為儲(chǔ)存宿主的原因仍然未知。扁桃體是豬在感染乙腦時(shí)關(guān)鍵的帶毒器官,能夠長(zhǎng)期攜帶病毒,可能與豬持續(xù)產(chǎn)生病毒血癥有關(guān)。同時(shí),豬扁桃體也是多種豬病原體的攜帶器官,多種重要的豬病原體可長(zhǎng)期存在于扁桃體中,然而由于缺少豬源扁桃體細(xì)胞系阻礙了相關(guān)研究的開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種豬扁桃體傳代細(xì)胞系（Pig tonsil cell,PT）,分析了該細(xì)胞系對(duì)豬主要病原體的易感性。發(fā)現(xiàn)PT細(xì)胞可以對(duì)JEV和豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）易感。然后分析了JEV對(duì)PT細(xì)胞的感染過(guò)程,發(fā)現(xiàn)PT細(xì)胞在病毒受體和... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

豬軟腭扁桃體的組織學(xué)切片

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論4圖1-2JEV的基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)Fig.1-2JEVgenomeorganizationa.JEV基因組;b.基因表達(dá);c.蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)a.Genomeorganization;b.Geneexpression;c.Polyproteinmembranetopology簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)病毒的循環(huán)過(guò)程包括吸附，膜融合，脫衣殼，核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，組裝和釋放(徐慶強(qiáng)等2013)。首先是病毒的糖蛋白E和細(xì)胞表面的一個(gè)或者多個(gè)附著因子結(jié)合(KONISHIetal.,1992)，然后病毒和附著因子相互作用，誘導(dǎo)觸發(fā)受體介導(dǎo)的依賴(lài)網(wǎng)格蛋白和不依賴(lài)網(wǎng)格蛋白的病毒內(nèi)吞作用(GUOetal.,2018)，進(jìn)入內(nèi)體后，經(jīng)過(guò)低PH的誘導(dǎo)，E蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，觸發(fā)病毒與和核內(nèi)體膜融合，病毒RNA的基因組釋放到細(xì)胞質(zhì)中，完成脫衣殼(LIUetal.,2017)。隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，翻譯成兩個(gè)多聚蛋白，多聚蛋白被相應(yīng)的蛋白酶切割成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的一些因子共同參與病毒基因組的復(fù)制，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成復(fù)制復(fù)合體，完成負(fù)鏈RNA的合成，正鏈RNA的合成，封鏈。加帽等過(guò)程(NEYTSetal.,1999)。新合成的RNA與C蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以出芽的方式形成未成熟的病毒粒子，就會(huì)結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的PrM蛋白和E蛋白，在反式高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，受到酸性環(huán)境的刺激，PrM蛋白構(gòu)象發(fā)生改變從而暴露單邊切割位點(diǎn)，被弗林蛋白酶切割成成熟的M蛋白，隨后M蛋白和E單邊發(fā)生重排，至此，成熟的病毒粒子就形成了。成熟的病毒粒子被分泌到細(xì)胞外，完成了病毒復(fù)制的過(guò)程�？偟膩�(lái)說(shuō)，病毒的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。1.3.3致病性JEV具有神經(jīng)嗜性，易造成嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其并發(fā)癥。JEV在體內(nèi)擴(kuò)增后，可以經(jīng)過(guò)血液循環(huán)，突破血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而致病(MANSFIELDetal.,2017)。JEV也可對(duì)宿主的腦、心臟、肝臟、丘腦、胸腺等組織造成?

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章豬扁桃體細(xì)胞系模型的建立1360℃30秒95℃15秒總共40個(gè)循環(huán)；總共1個(gè)循環(huán)。然后用函數(shù)公式計(jì)算GAPDH的CT值，并且計(jì)算出各樣品基因與GAPDH的mRNA表達(dá)的相對(duì)含量及percentageGAPDH(%GAPDH)，分別為：2-ΔCT、100×2-ΔCT，其中ΔCT=(CT目的基因mRNA-CTGAPDHmRNA)。2.2.9豬扁桃體傳代細(xì)胞系形態(tài)觀察PT細(xì)胞消化后鋪24孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)。在不同的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，棄上清培養(yǎng)基，加入PBS沖洗3次，加入1mL的PBS在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。2.3結(jié)果2.3.1傳代細(xì)胞系的鑒定首先檢測(cè)了細(xì)胞中是否含有支原體和細(xì)菌等污染，如圖所示，A為檢測(cè)細(xì)胞的污染物，泳道1為支原體檢測(cè)，泳道2為細(xì)菌檢測(cè)，泳道3和4為陰性對(duì)照，M1為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，結(jié)果檢測(cè)均為陰性。說(shuō)明細(xì)胞沒(méi)有污染，狀態(tài)良好。然后確定了正常細(xì)胞的嘌呤霉素最小致死濃度為2μg/μL，用這個(gè)濃度的嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行了篩選，篩選幾代后開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞單克隆，將細(xì)胞無(wú)限稀釋然后在96孔板中逐漸培養(yǎng)擴(kuò)大，再次稀釋培養(yǎng)擴(kuò)大，經(jīng)過(guò)三次克隆后就得到了一株比較純正的豬扁桃體上皮細(xì)胞系，并且可以無(wú)限增殖，可以擴(kuò)大培養(yǎng)30代以上，顯微鏡下觀察到全部為角蛋白CK-19陽(yáng)性的上皮細(xì)胞。圖2-1細(xì)胞系鑒定Fig.2-1Identificationofcelllinesa.細(xì)胞污染檢測(cè);b.上皮細(xì)胞純度檢測(cè)a.Identificationofcellcontamination;b.Identificationofcellpurityab


本文編號(hào)：3521383