禽流感作為重要的人畜共患病,一直以來對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生健康造成重大影響。H9N2禽流感病毒感染家禽后雖不會造成很高的死亡率,但被感染的雞抵抗力降低,導致雞對其他病原易感而引發(fā)二次感染,對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經濟損失。當禽流感病毒感染哺乳動物時其體內的RIG-I和MDA5受體能識別病毒RNA產生天然免疫反應,天然免疫系統(tǒng)的激活會引起下游的信號通路產生級聯反應,并釋放干擾素（IFN）和多種炎性因子發(fā)揮抗病毒效應。有研究表明在雞的體內缺乏RIG-I受體,但當雞被禽流感病毒感染時雞體內同樣可產生抗病毒作用的IFN-I。在哺乳動物MDA5的研究中,發(fā)現MDA5在抗流感病毒感染過程中可發(fā)揮識別病毒RNA并誘導IFN應答的作用,雖雞的體內存在MDA5受體,但其在抗流感病毒中的功能并不清楚。因此本研究擬通過CRISPR/Cas9技術構建DF1細胞mda5功能失活的細胞系,評價mda5對H9N2禽流感病毒誘導IFN-β及對病毒增殖的影響,為闡釋禽流感誘導IFN信號通路及開發(fā)適合H9N2流感病毒疫苗株增殖細胞系奠定基礎。本研究首先擬通過將既可表達Cas9蛋白又可直接轉錄sgRNA的質粒轉染到細胞完成基因突變... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

DF1細胞轉染效率的觀察Fig.4-1ObservethetransfectionefficiencyofDF1cellsA:在熒光顯微鏡下觀察熒光細胞比率；B:自然光下對應觀察細胞狀態(tài)

圖 4-2 轉染 PX459 質粒于 DF1 細胞構建表達 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的 DF1 細胞系Fig.4-2 Construction of DF1 cell line expressing CRISPR/Cas9 system by transfecting PX459plasmid in DF1 cellsA:DF1 細胞轉染 PX459 質粒后加入嘌呤霉素篩選；B:未轉染質粒的 DF1 細胞加入嘌呤霉素篩選圖中標尺代表實際尺寸為 10μm4.2 慢病毒包裝條件的確定DF1 細胞中直接轉染 PX459 質粒未能成功構建表達 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的細胞系，因此后續(xù)擬運用慢病毒系統(tǒng)進行細胞系構建，由于本實驗室前期并未開展慢病毒系統(tǒng)相關研究，因此首先開展確定慢病毒包裝條件的試驗。本研究選用帶熒光標簽質粒 PWPXL 作為慢病毒骨架質粒，將包裝的熒光慢病毒感染細胞，通過感染細胞中熒光細胞比例來評價慢病毒包裝效率。首先探究了在 293T 細胞（圖 4-3 所示）、293A 細胞（圖 4-4 所示）及 293FT 細胞（圖 4-5 所示）中，不同包膜質粒對慢病毒包裝效率的影響，將收獲的慢病毒分別感染細胞，結果顯示僅在 293FT 細胞中以

圖 4-3 293T 細胞轉染慢病毒質粒后觀察熒光ig. 4-3Observe fluorescence after transfection of lentiviral plasmid in 29A、B、C、D 分別表示以不同包膜質粒包裝慢病毒圖中標尺代表實際尺寸為 10μm

【參考文獻】：
期刊論文
[1]禽類高致病性禽流感的流行特點與防控[J]. 欒志松.  山東畜牧獸醫(yī). 2018(01)
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[3]我國低致病性禽流感研究概況[J]. 黃建龍,朱春霞,劉道新.  動物醫(yī)學進展. 2014(04)
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本文編號：3517322