旨在揭示miR-33a在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中的生物學(xué)功能。本研究以15日齡雄性綿羊背部皮下前體脂肪細(xì)胞為試驗材料,所有的試驗均設(shè)立3個重復(fù);利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-33a的靶基因,并通過雙熒光素酶報告試驗對預(yù)測的潛在靶基因進行驗證;用qPCR和Western blotting分別檢測miR-33a、Lipin1和IRS2及其編碼蛋白的表達(dá),以揭示miR-33a與其靶基因在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)規(guī)律;慢病毒介導(dǎo)實現(xiàn)miR-33a的過表達(dá)和干擾后,檢測Lipin1、IRS2和成脂標(biāo)志基因的表達(dá),并用油紅O染色檢測脂滴沉積能力,以解析miR-33a對其靶基因的調(diào)節(jié)機制。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-33a與Lipin1和IRS2 3′-UTR都存在結(jié)合位點,miR-33a顯著下調(diào)Lipin1和IRS2野生型雙熒光質(zhì)粒的相對熒光活性（P<0.05）;在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中,miR-33a與Lipin1和IRS2的表達(dá)趨勢相反;過表達(dá)miR-33a后,顯著下調(diào)了Lipin1（P<0.01）和IRS2（P<0.05）及其編碼蛋白以及成脂標(biāo)志基因的表達(dá);干擾miR-3... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2020,51(04)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

體外培養(yǎng)的綿羊前體脂肪細(xì)胞

預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-33a的種子區(qū)序列(UGCAUUG)在Lipin1 CDS(911～916 nt)和3′-UTR(679～684 nt和1 469～1 474 nt)存在3個結(jié)合位點,在IRS2 3′-UTR(994～1 000 nt和1 532～1 538 nt)存在2個結(jié)合位點(圖3)。我們分別構(gòu)建了含Lipin1 3′-UTR(679～684 nt)和IRS2 3′-UTR(1 532～1 538 nt)序列的雙熒光素酶載體驗證靶標(biāo)關(guān)系。圖3 miR-33a與Lipin1和IRS2 mRNA預(yù)測的結(jié)合位點

圖2 綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中miR-33a、Lipin1和IRS2 mRNA和蛋白的表達(dá)趨勢熒光活性檢測結(jié)果表明,空載體組與其對照的熒光活性差異不顯著,Lipin1和IRS2野生型組的熒光活性顯著低于各自對照(P<0.05),但Lipin1和IRS2突變組與其對照的熒光活性差異不顯著(圖4)。說明,miR-33a在Lipin1和IRS2 3′-UTR存在結(jié)合位點,Lipin1和IRS2是miR-33a的靶基因。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[J]. 郭紅芳,昝林森,孫永剛.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2014(02)
[2]綿羊LPIN1基因的克隆和mRNA表達(dá)研究[J]. 魏琳琳,高晉生,王景霖,程俐芬,喬利英,賈夏麗,張靜,楊凱捷,劉建華,梁琛,劉文忠.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2013(09)



本文編號：3506205