疫苗免疫是預(yù)防豬病毒性疾病的重要手段,而且隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)混合感染是豬發(fā)病的一種常見形式,因此“一針防多病”是對(duì)疫苗研究提出的新要求。已報(bào)道利用PRV作為活病毒載體,將外源基因插入到PRV基因組中是多價(jià)苗研制的一種重要方法,并且取得了一定的防治效果。PRV和PPV都是導(dǎo)致母豬繁殖障礙性疾病的重要病原,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。已知PPV對(duì)PCV-2導(dǎo)致的PMWS在臨床癥狀表現(xiàn)上具有明顯的增強(qiáng)作用,而PBoV’恰好又是在患有PMWS的仔豬中被發(fā)現(xiàn)的,同時(shí)有報(bào)道稱PBoV與仔豬呼吸道感染以及仔豬腹瀉等癥狀有關(guān),但關(guān)于PBoV在疫苗研制上的研究還是空白。因此,以弱毒株偽狂犬病毒為載體,構(gòu)建一株可以同時(shí)預(yù)防PRV、PBoV、PPV的重組病毒,是非常具有研究與應(yīng)用價(jià)值的。而且目前在PBoV的診斷上方法較單一,主要集中在PCR檢測,因此本實(shí)驗(yàn)還制備PBoV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的單克隆抗體,為后續(xù)研制PBoV的ELISA診斷試劑盒打下一定基礎(chǔ)。1. PBoV結(jié)構(gòu)蛋白VP2單克隆抗體的研制從PBoV陽性病料中成功克隆出VP2基因,并連接到pET-30a載體中,鑒定正確后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中誘導(dǎo)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表(ABBREVIATION)
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬細(xì)小病毒的概述
        1.1.1 豬細(xì)小病毒病的研究進(jìn)展
        1.1.2 PPV基因組結(jié)構(gòu)及主要編碼蛋白
        1.1.3 PPV的生物學(xué)性質(zhì)
        1.1.4 PPV疫苗的研究進(jìn)展
    1.2 豬博卡病毒的概述
        1.2.1 豬博卡病毒的研究進(jìn)展
        1.2.2 豬博卡病毒基因組結(jié)構(gòu)及主要編碼蛋白
        1.2.3 豬博卡病毒的診斷與預(yù)防
    1.3 豬偽狂犬病毒的概述
        1.3.1 豬偽狂犬病的研究進(jìn)展
        1.3.2 偽狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)及主要編碼蛋白功能研究
        1.3.3 偽狂犬病毒基因缺失疫苗的研究
第2章 研究目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)菌、病毒和細(xì)胞
        3.1.2 載體
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 主要緩沖液與相關(guān)試劑的配制
            3.1.4.1 細(xì)菌與細(xì)胞培養(yǎng)基相關(guān)試劑
            3.1.4.2 ELISA實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
            3.1.4.3 SDS-PAGE和Western-blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
            3.1.4.4 原核表達(dá)蛋白純化相關(guān)試劑
            3.1.4.5 空斑實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)引物
        3.2.2 目的片段的擴(kuò)增
        3.2.3 目的片段及載體的酶切及連接反應(yīng)
        3.2.4 連接產(chǎn)物和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.5 質(zhì)粒的制備與酶切鑒定
        3.2.6 原核蛋白的表達(dá)
        3.2.7 目的蛋白的純化
        3.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.9 單克隆抗體制備過程中動(dòng)物免疫程序
        3.2.10 細(xì)胞融合
        3.2.11 方陣滴定法確定最佳包被濃度
        3.2.12 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        3.2.13 雜交瘤細(xì)胞的克隆及抗體的制備
        3.2.14 SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)
        3.2.15 Western-blot分析
        3.2.16 病毒基因組的大量提取
        3.2.17 空斑實(shí)驗(yàn)
        3.2.18 制備檢測重組病毒的PCR模板
        3.2.19 重組病毒的純度檢測
        3.2.20 病毒生長曲線的測定
        3.2.21 病毒TCID_(50)的測定
        3.2.22 重組病毒小鼠免疫
        3.2.23 ELISA抗體水平檢測
        3.2.24 中和抗體水平檢測
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 單克隆抗體的制備
        4.1.1 PBoV-VP2原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.1.2 PBoV-VP2原核表達(dá)和純化
        4.1.3 蛋白最佳包被濃度的確定
        4.1.4 免疫小鼠效價(jià)的確定
        4.1.5 單克隆抗體的Western-blot驗(yàn)證
    4.2 重組病毒的制備實(shí)驗(yàn)
        4.2.1 中間轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        4.2.2 重組病毒的篩選與純化
        4.2.3 重組病毒LacZ基因的檢測
        4.2.4 重組病毒中蛋白表達(dá)的鑒定
        4.2.5 重組病毒的增殖曲線
        4.2.6 重組病毒在不同細(xì)胞上的增殖滴度
        4.2.7 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性研究
        4.2.8 病毒免疫小鼠的ELISA抗體水平檢測
        4.2.9 病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平檢測
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 單克隆抗體制備過程中免疫原的制備
        5.1.2 單克隆抗體的驗(yàn)證
        5.1.3 親本毒株的選擇
        5.1.4 轉(zhuǎn)移載體與親本株病毒基因組
        5.1.5 重組病毒的生物學(xué)特性研究
        5.1.6 重組病毒誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫反應(yīng)
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3503302