羊奶富含短、中鏈脂肪酸以及不飽和脂肪酸，能有效預防人類的某些代謝疾病，因而具有良好的保健功能。羊奶的獨特有益脂肪酸的含量與其乳腺乳脂代謝密切相關，因此研究山羊乳腺組織的脂肪酸代謝機理，有助于提高乳品質(zhì)。過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma，PPARG）是目前發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中調(diào)控脂肪酸代謝的核心轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控脂肪酸代謝基因網(wǎng)絡，影響脂滴的形成，是脂肪細胞脂肪酸沉積的決定因子。但目前對奶山羊泌乳過程中PPARG對乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控研究卻鮮有報道。本研究以薩能奶山羊不同生理時期乳腺組織為材料，進行轉(zhuǎn)錄組測序，探討山羊乳腺組織的mRNA的表達情況。克隆PPARG的不同亞型，驗證他們在乳腺組織中的表達情況。通過特異性激動劑激活，腺病毒介導的RNAi干擾，以及腺病毒介導的過表達技術研究PPARG基因在山羊乳腺上皮細胞中的功能。結果表明，PPARG能夠廣泛地調(diào)控乳腺上皮細胞中脂肪酸代謝基因網(wǎng)絡，改變細胞內(nèi)脂肪酸的組成，是脂肪酸調(diào)控的重要因子。PPARG可能在山羊泌乳過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究的主要結果如下... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 羊奶的成分及其營養(yǎng)價值概述
    1.2 泌乳過程中脂肪酸代謝研究進展
        1.2.1 乳腺細胞外源吸收脂肪酸
        1.2.2 脂肪酸的活化與運輸
        1.2.3 脂肪酸的從頭合成與去飽和化
        1.2.4 甘油三酯的合成與乳脂滴的組裝
        1.2.5 SREBP 與乳腺脂肪酸代謝
    1.3 PPAR 家族與脂肪酸代謝
        1.3.1 PPAR 家族及其組織表達分布
        1.3.2 PPAR 家族與其激動劑
        1.3.3 PPARG 調(diào)控脂肪酸代謝
        1.3.4 PPARG 與疾病
    1.4 PPARG 在泌乳過程中的功能研究
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 山羊乳腺組織轉(zhuǎn)錄組測序與生物信息學分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑和儀器
        2.1.2 樣品采集與 RNA 提取
        2.1.3 mRNA 的純化與處理
        2.1.4 文庫構建
        2.1.5 上機測序
        2.1.6 數(shù)據(jù)分析與序列組裝
        2.1.7 轉(zhuǎn)錄本的功能注釋
        2.1.8 基因表達豐度分析
    2.2 結果
        2.2.1 轉(zhuǎn)錄組 de novo 拼接結果
        2.2.2 Unigene 長度和 GC 含量分析
        2.2.3 Unigene 功能注釋
        2.2.4 GO 分類
        2.2.5 KOG 分類
        2.2.6 脂肪酸代謝過程中的幾個關鍵因子
    2.3. 討論
        2.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序結果的質(zhì)量
        2.3.2 山羊乳腺組織中脂肪酸代謝相關基因
    2.4 本章小結
第三章 PPARG 的克隆、生物信息學分析與組織表達
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 引物設計
        3.1.4 山羊不同組織以及不同泌乳時期乳腺組織的采集
        3.1.5 總 RNA 的提取與 cDNA 的合成
        3.1.6 PPARG 的克隆與鑒定
        3.1.7 PPARG 的生物信息學分析
        3.1.8 熒光定量檢測 PPARG
        3.1.9 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結果
        3.2.1 PPARG1 和 PPARG2 的克隆
        3.2.2 同源性分析
        3.2.3 結構預測與分析
        3.2.4 組織表達分析
        3.2.5 PPARG 在泌乳不同時期的表達差異
    3.3 討論
        3.3.1 奶山羊 PPARG 基因的克隆
        3.3.2 奶山羊 PPARG 基因的結構分析
        3.3.3 PPARG 組織表達譜
    3.4 本章小結
第四章 山羊乳腺上皮細胞中 PPARG 的活性檢測
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要材料
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 PPRE 序列和定量引物的合成
        4.1.4 載體構建
        4.1.5 細胞培養(yǎng)與處理
        4.1.6 RNA 的提取與熒光定量 PCR 檢測
        4.1.7 細胞轉(zhuǎn)染與處理
        4.1.8 熒光素酶檢測
        4.1.9 MTT 試驗
        4.1.10 細胞內(nèi)脂肪酸的提取
        4.1.11 脂肪酸的檢測
        4.1.12 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結果
        4.2.1 pGL3-PPRE 載體的構建
        4.2.2 PPRE 在山羊乳腺細胞中的活性分析
        4.2.3 PPRE 在 MCF-7 細胞中的活性分析
        4.2.4 羅格列酮影響乳腺上皮細胞中脂肪酸代謝基因的表達
        4.2.5 羅格列酮激活 PPARG 影響乳腺上皮細胞的增殖
        4.2.6 羅格列酮激活 PPARG 對乳腺上皮細胞中脂肪酸組成的影響
    4.3 討論
        4.3.1 PPARG 對 PPRE 熒光素酶活性的影響
        4.3.2 羅格列酮激活 PPARG 對脂肪酸代謝相關基因的影響
        4.3.3 羅格列酮激活 PPARG 對細胞內(nèi)脂肪酸組成的影響
        4.3.4 PPARG 與乳腺上皮細胞的增殖
    4.4 小結
第五章 PPARG 基因的 RNA 干擾研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 主要儀器設備
        5.1.2 主要試驗材料
        5.1.3 山羊 PPARG 基因的 shRNA 干擾序列的設計與合成
        5.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 載體構建
        5.1.5 pDsRed1-C1-PPARG 表達載體的構建
        5.1.6 shRNA 有效序列的篩選
        5.1.7 重組腺病毒載體的構建
        5.1.8 腺病毒的包裝、擴增與滴度測定
        5.1.9 腺病毒感染乳腺上皮細胞最佳 MOI 的測定
        5.1.10 PPARG 基因的 RNA 干擾效率檢測
        5.1.11 western blotting 試驗
        5.1.12 熒光定量 PCR
    5.2 結果
        5.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 載體的構建
        5.2.2 pDsRed1-C1- PPARG 載體的構建
        5.2.3 shRNA 有效干擾序列的篩選
        5.2.4 重組腺病毒載體的構建
        5.2.5 腺病毒的包裝、擴增及滴度測定
        5.2.6 最佳感染復數(shù) MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
        5.2.7 PPARG 基因干擾效率的檢測
        5.2.8 PPARG 基因干擾對脂肪酸代謝相關基因的影響
    5.3 討論
        5.3.1 腺病毒的包裝
        5.3.2 有效 shRNA 的篩選
        5.3.3 干擾 PPARG 對脂肪酸代謝相關基因的影響
    5.4 本章小結
第六章 PPARG1 的過表達研究
    6.1 試驗材料與方法
        6.1.1 主要試驗材料
        6.1.2 主要試驗儀器
        6.1.3 重組腺病毒載體構建
        6.1.4 超表達病毒 Ad-PPARG1 包裝、擴增
        6.1.5 細胞培養(yǎng)與處理
        6.1.6 總 RNA 的提取與熒光定量
        6.1.7 Western blotting
        6.1.8 超表達效率檢測
        6.1.9 細胞內(nèi)脂肪酸的提取
        6.1.10 脂肪酸的檢測
        6.1.11 數(shù)據(jù)處理
        6.1.12 超表達 PPARG1 對脂肪酸代謝影響網(wǎng)絡圖構建
    6.2 試驗結果
        6.2.1 pAd-PPARG1 腺病毒載體的構建
        6.2.2 pAd-PPARG1 腺病毒的包裝與擴增
        6.2.3 最佳感染復數(shù) MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
        6.2.4 PPARG1 基因超表達效率的檢測
        6.2.5 過表達 PPARG1 影響脂肪酸代謝相關基因
        6.2.6 過表達 PPARG1 對脂肪酸組成的影響
        6.2.7 過表達 PPARG1 基因網(wǎng)絡構建
    6.3 討論
        6.3.1 PPARG1 對脂肪酸代謝的影響
        6.3.2 脂肪酸代謝網(wǎng)絡構建
        6.3.3 PPARG1 對脂肪酸組成的影響
    6.4 本章小結
第七章 PPARG2 的過表達研究
    7.1 試驗材料與方法
        7.1.1 主要試驗材料
        7.1.2 主要試驗儀器
        7.1.3 重組腺病毒載體構建
        7.1.4 超表達病毒 Ad-PPARG2 包裝、擴增
        7.1.5 細胞培養(yǎng)與處理
        7.1.6 總 RNA 的提取與熒光定量
        7.1.7 Western blotting
        7.1.8 超表達效率檢測
        7.1.9 細胞內(nèi)脂肪酸的提取
        7.1.10 脂肪酸的檢測
        7.1.11 數(shù)據(jù)處理
        7.1.12 超表達 PPARG1 對脂肪酸代謝影響網(wǎng)絡圖構建
    7.2 試驗結果
        7.2.1 pAd-PPARG2 腺病毒載體的構建
        7.2.2 pAd-PPARG2 腺病毒的包裝與擴增
        7.2.3 最佳感染復數(shù) MOI（Multiplicity Of Infection）的探索
        7.2.4 PPARG2 基因超表達效率的檢測
        7.2.5 過表達 PPARG2 影響脂肪酸代謝相關基因
        7.2.6 過表達 PPARG2 對脂肪酸組成的影響
        7.2.7 過表達 PPARG2 基因網(wǎng)絡構建
    7.3 討論
        7.3.1 病毒載體的高效構建
        7.3.2 基因表達后的翻譯調(diào)控
        7.3.3 PPARG 與脂肪酸代謝網(wǎng)絡
        7.3.4 PPARG 與脂肪酸的去飽和化
    7.4 本章小結
結論
本研究的創(chuàng)新點
存在問題及展望
參考文獻
附錄
縮略詞（Abbreviation）
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]奶山羊SCD基因CDS區(qū)的克隆、序列分析及過表達[J]. 石恒波,羅軍,朱越,王紫騫,趙旺生.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2012(24)
[2]西農(nóng)薩能奶山羊甘油三酯水解酶基因（ATGL）的cDNA克隆與組織表達分析[J]. 滕炎玲,羅軍,李君,趙旺生,王楨,王維,胡仕良.  農(nóng)業(yè)生物技術學報. 2010(06)
[3]批量快速測定法測定標志基因為GFP的重組病毒滴度[J]. 江千里,王健民,溫麗敏,江汕,周虹.  第二軍醫(yī)大學學報. 2002(09)

碩士論文
[1]西農(nóng)薩能羊TIP47基因的克隆分析與RNA干擾研究[D]. 郝娟.西北農(nóng)林科技大學 2011



本文編號：3502059