LIGHT是腫瘤壞死因子超家族第14個(gè)成員,在活化樹突細(xì)胞、共刺激T細(xì)胞以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面有著重要作用。豬是既是重要的肉類來源,也是研究人類相關(guān)疾病的動物模型。所以本課題以豬作為研究對象,對豬LIGHT基因進(jìn)行了克隆表達(dá)以及生物學(xué)性質(zhì)鑒定。首先,我們分析了豬LIGHT的基因序列,與其他腫瘤壞死因子超家族成員一樣,豬LIGHT也是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,含有一個(gè)預(yù)測的跨膜區(qū)、一個(gè)金屬酶切位點(diǎn)、兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基以及一個(gè)TNF同源結(jié)構(gòu)域。為了研究LIGHT與免疫系統(tǒng)的關(guān)系,我們?nèi)诤狭素iLIGHT的胞外段（psLIGHT）和Fc片段,構(gòu)建了一個(gè)新的蛋白分子psLIGHT-Fc。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng),以其低成本,高生產(chǎn)率,操作簡單等優(yōu)點(diǎn)而備受親睞,所以我們設(shè)計(jì)帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物,通過Overlap-PCR方法獲得psLIGHT-Fc基因,酶切后插入pET28a原核表達(dá)載體中,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）,經(jīng)Protein A親和層析柱純化得到約44.3KDa的psLIGHT-Fc蛋白,并且對其進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析鑒定。p... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－】人ＬＩＧＨＴ基因的染色體定位及其ＤＮＡ分子結(jié)構(gòu)（摘自Ｇｒａｎｇｅｒ，２００１）??

、黒色素瘤細(xì)胞系中，ＩＦＮ－Ｙ可誘導(dǎo)ＧＩＬＴ表達(dá)［４°］。在黑色素瘤細(xì)胞系中，ＩＦＮ－Ｙ誘導(dǎo)ＧＩＬＴ表達(dá)需要ＳＴＡＴ１的協(xié)助，因?yàn)椋樱裕粒裕笨蓡幼訁^(qū)的ＳＴＡＴ１結(jié)合區(qū)域的寡核苷酸上［４１］。??ＧＩＬＴ的生物學(xué)作用??１參與ＩＩ型ＭＨＣ抗原的呈遞??ＧＩＬＴ的一個(gè)重要功能就是加強(qiáng)ＩＩ型ＭＨＣ抗原的呈遞，它通過還原ＭＨＣＩＩ結(jié)合位點(diǎn)，從而促進(jìn)抗原呈遞。大多數(shù)抗原的呈遞都需要Ｇ例如雞蛋中的溶菌酶（ＨＥＬ）、黑色素細(xì)胞分化抗原、病毒包膜蛋Ｌ含有４個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵［４２］（如圖所示），所以它是研究抗原呈遞過程變的最佳模型。ＨＥＬ的７４－８８位氨基酸殘基中含有２個(gè)半胱氨酸殘基，氨酸殘基參與二硫鍵的形成，有研究證據(jù)表明抗原表位的呈遞需要的還原，而ＧＩＬＴ參與了該過程中的二硫鍵還原，暴露出Ｉ－Ａｂ抗原表

第四章豬ＬＩＧＨＴ的克隆表達(dá)及生物學(xué)性質(zhì)的研究如下：??５＇－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ?ＣＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡ－３，?ｉＢａｍＨＤ??５＇－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ?ＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣ－３，?｛ＨｉｎｄＩＩＩ）??ＳＰ１斜體部分為ＢａｍＨ丨酶切位點(diǎn)，ＳＰ２斜體部分為Ｈｉｎｄ?１１丨酶切位點(diǎn)。??．?２?ＰＣＲ?反應(yīng)??ｏｖｅｒ丨ａｐ?ＰＣＲ擴(kuò)增ｐｓＬＩＧＨＴ－Ｆｃ基因??——Ｆｃｌ??


本文編號：3494165