本論文驗證豬肌肉特異性基因CAPN3肝臟特異性基因TTR啟動子的活性。采用豬肌肉特異性基因myf6的啟動子與MyoD基因的CDS序列,構(gòu)建在豬肌肉特異性高效表達MyoD的重組體；采用豬肝臟特異性基因TTR的啟動子與BGL1基因的CDS序列,構(gòu)建在豬肝臟特異性高效表達BGLl的重組體,之后通過顯微注射制作轉(zhuǎn)基因小鼠,為培育高產(chǎn)低耗轉(zhuǎn)基因豬建立轉(zhuǎn)基因模型。目前取得的主要研究成果：1)肌肉組織特異性表達基因CAPN3啟動子的活性分析。在GeneBank數(shù)據(jù)庫中篩選在豬肌肉組織特異性表達基因CAPN3及其DNA序列,取其翻譯起始位點ATG上游2300bp為啟動子序列作為研究對象,運用NNPP、 DNAman、ConSit進行序列的核心啟動子區(qū)域、不同物種同源性、同源性最高的區(qū)域轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子進行預(yù)測分析；據(jù)此,構(gòu)建了8個缺失片段的熒光表達載體,分別轉(zhuǎn)染C2C12、3T3、Hepal-6細胞,確定第3個缺失片段P3（-705-0）活性最高,并且具有較強的組織特異性。2)肝臟特異性表達基因TTR啟動子的活性分析。在GeneBank數(shù)據(jù)庫中篩選在豬肝臟特異性表達基因TTR,以翻譯起始位點ATG上游25... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫對照表
第一章 動物轉(zhuǎn)基因研究進展
    1 前言
    2 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展概況
    3 轉(zhuǎn)基因動物制備方法
        3.1 原核顯微注射法
        3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法
        3.3 胚胎干細胞介導(dǎo)法
        3.4 精子載體法
        3.5 體細胞核移植法
        3.6 性腺注射轉(zhuǎn)基因法
        3.7 RNA干涉法
        3.8 基因打靶結(jié)合克隆法
    4 轉(zhuǎn)基因動物的鑒定
        4.1 轉(zhuǎn)基因整合檢測
        4.2 轉(zhuǎn)基因表達檢測
    5 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在畜牧生產(chǎn)方面的應(yīng)用
        5.1 提高生產(chǎn)性能
        5.2 抗逆新品種(系)的培育
    6 轉(zhuǎn)基因技術(shù)對畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域的發(fā)展前景
    7 目的與意義
第二章 肌肉和肝臟組織特異性啟動子活性分析
    1 前言
    2 試驗材料
        2.1 主要的儀器設(shè)備
        2.2 主要試劑和藥品
        2.3 主要試劑的配制
        2.4 主要生物學(xué)軟件
        2.5 載體和菌種
    3 試驗方法和步驟
        3.1 豬CAPN3基因和TTR基因啟動子的PCR擴增
        3.2 熒光檢測載體制備及酶切鑒定
        3.3 啟動子活性測定
    4 結(jié)果與分析
        4.1 豬CAPN3啟動子的克隆及功能分析
        4.2 轉(zhuǎn)染細胞熒光活性的檢測
        4.3 豬TTR啟動子的克隆及功能分析
        4.4 轉(zhuǎn)染細胞雙熒光素酶活性的檢測
    5 討論
第三章 肌肉和肝臟特異性表達外源基因載體的構(gòu)建
    1 前言
    2 試驗材料
        2.1 主要儀器設(shè)備
        2.2 試驗試劑與試劑盒
        2.3 主要溶液配方
        2.4 菌種和質(zhì)粒
    3 試驗方法
        3.1 中間載體pMyoDEGFP-N1的構(gòu)建與鑒定
        3.2 肌肉特異性表達載體pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1的構(gòu)建與鑒定
        3.3 中間載體pGL-BGLhis-control的構(gòu)建與鑒定
        3.4 肝臟特異性表達載體pTTRs-BGLhis-control的構(gòu)建與鑒定
        3.5 細胞的培養(yǎng)
        3.6 RT-PCR檢測外源基因的轉(zhuǎn)錄
    4 結(jié)果與分析
        4.1 中間載體pMyoDEGFP-N1的構(gòu)建與鑒定
        4.2 肌肉特異性表達載體pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1的構(gòu)建與鑒定
        4.3 中間載體pBGLhis-control的構(gòu)建與鑒定
        4.4 肝臟特異性表達載體pTTRs-BGLhis-control的構(gòu)建與鑒定
        4.5 pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染C2C12 mRNA水平的檢測
        4.6 pTTRs-BGLhis-control載體轉(zhuǎn)染Hepal-6 mRNA水平檢測
    5 討論
第四章 肌肉特異表達外源基因轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與鑒定
    1 前言
    2 試驗材料
        2.1 主要儀器設(shè)備
        2.2 試驗試劑與試劑盒
        2.3 試驗動物
    3 試驗方法
        3.1 顯微注射用DNA片段的制備及純化
        3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    4 試驗結(jié)果
        4.1 顯微注射用DNA片段的制備及純化
        4.2 陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得
        4.3 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測
    5 討論
第五章 結(jié)論
    1 本研究獲得的結(jié)果
    2 下一步的研究內(nèi)容
參考文獻
附錄1：pSV40-myf6-MyoDEGFP-N1載體的序列
附錄2：pTTRs-BGLhis-control載體的序列
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]SV40增強子對奶牛β-酪蛋白啟動子活性的影響[J]. 鐘宇,邵正,江黎明.  中國細胞生物學(xué)學(xué)報. 2013(02)
[2]Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的制備[J]. 楊偉偉,殷筱舒,殷黎靜,張艷麗,李高天,劉桂杰,俞利平,顧美兒,吳寶金.  杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2013(01)
[3]A33啟動子結(jié)腸癌特異性探究及SV40增強子對其轉(zhuǎn)錄活性影響[J]. 鐘丹,鄭水娣,諶賀寬子,袁素敬,章康健.  中國細胞生物學(xué)學(xué)報. 2011(11)
[4]異源基因α1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶與增強型綠色熒光蛋白融合對熒光蛋白表達的影響[J]. 唐晶,謝柏臻,李鵬飛,姚琴,趙渙閣,卓慧欽,劉祖國,趙永祥.  中華細胞與干細胞雜志(電子版). 2011(02)
[5]H2-K/β2-m雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定[J]. 杜明娥,邱玉華,魏婧,竇非.  東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2011(02)
[6]動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J]. 張瑞杰,苗向陽.  中國細胞生物學(xué)學(xué)報. 2010(05)
[7]現(xiàn)代生物育種的前沿與未來[J]. 李寧.  中國家禽. 2010(18)
[8]植物組織特異性啟動子的研究進展[J]. 糜賽男,曹明富.  生物學(xué)教學(xué). 2010(07)
[9]轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)及其研究進展[J]. 謝蓮萍.  畜牧與飼料科學(xué). 2009(09)
[10]轉(zhuǎn)基因小鼠在現(xiàn)代生命科學(xué)中的應(yīng)用[J]. 原麗紅,林本夫.  生物技術(shù)通報. 2009(S1)

博士論文
[1]人HT、DAF和CD59基因聯(lián)合轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及其抗異種器官移植免疫排斥反應(yīng)的研究[D]. 劉秉乾.天津醫(yī)科大學(xué) 2006



本文編號：3487019