H1N1亞型流感病毒NS1效應(yīng)區(qū)位點變異效應(yīng)研究
發(fā)布時間：2021-11-08 05:06
本研究利用定點突變技術(shù),對H1N1亞型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）毒株NS1蛋白效應(yīng)區(qū)的108、123、125和189位進行氨基酸的4位點協(xié)同突變,再對這4個位點分別進行氨基酸的單位點突變,構(gòu)建未變異的NS1重組表達質(zhì)粒pCAGGS-NS1wt以及變異的NS1重組表達質(zhì)粒pCAGGS-NS1mut,包括pCAGGS-NS1R108K、pCAGGS-NS1V123I、pCAGGS-NS1E125D、pCAGGS-NS1G189D、pCAGGS-NS1pdm。應(yīng)用反向遺傳技術(shù)拯救出野生型未變異病毒ReNS1wt以及5株位點變異病毒ReNS1R108K、ReNS1V123I、ReNS1E125D、ReNS1G189D、ReNS1pdm。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,NS1...
【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：82 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
流感病毒的粒子結(jié)構(gòu)圖
第一篇文獻綜述A型流感病毒NS1蛋白研究進展4分開[13]。此外，NS1蛋白還具有2個核定位信號序列（nuclearlocalizationsequence，NLS）和1個核輸出信號（nuclearexportsignal，NES）兩個NLS分別位于RBD和ED，其中位于RBD的NLS由位于第35~41位氨基酸的RLRRDQK組成[14]，位于ED的NLS由位于第219~237位氨基酸的KRKMARTARSKVRRDKMAD組成，部分NS1蛋白由于C端的截短具有1個NLS，NES由位于第138~147位氨基酸的FDRLETLILL組成[15]。通過X射線衍射技術(shù)解析NS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，ED結(jié)構(gòu)域的3個β-折疊的整體平移，致使ED的作用界面發(fā)生變化，因此全長NS1蛋白晶體中，NS1蛋白并不是簡單的2個單體聚集構(gòu)成二聚體結(jié)構(gòu)，而是一個NS1單體的RBD和ED分別與另一個單體的RBD和ED相互作用產(chǎn)生交互式結(jié)合的鎖鏈二聚體結(jié)構(gòu)[16]，每3條二聚體又形成一個螺旋狀管狀寡聚[17]。下圖2008年對非結(jié)構(gòu)蛋白NS1X-衍射晶體結(jié)構(gòu)首次測定解析。圖1.2非結(jié)構(gòu)蛋白NS1X-衍射晶體結(jié)構(gòu)（Bornholdt,ZacharyA,Prasad,B.V，2008）Figure1.2X-raydiffractioncrystalstructureofnon-structuralproteinNS1（Bornholdt,ZacharyA,Prasad,B.V，2008）2.1NS1蛋白的RNA結(jié)合域NS1蛋白的RBD位于N末端，由3個α螺旋（分別是第1~30位氨基酸，第
第一篇文獻綜述A型流感病毒NS1蛋白研究進展6Ⅱ（Polyadenylatebindingprotein，PABII）結(jié)合時，宿主細胞的前體RNA受到抑制，3’端的修飾或細胞核內(nèi)poly(A)尾的延長受阻，進而抑制宿主自身mRNA的產(chǎn)生及核輸出（包括在抗病毒作用中發(fā)揮重要作用的IFN-β的mRNA）；除此之外，NS1蛋白還可與雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（double-strandedRNA-dependentproteinkinases，PKR）、p85β蛋白、TRIM25蛋白和一些PDZ結(jié)構(gòu)域的配體蛋白等相互作用，從而發(fā)揮不同的功能[28]。蛋白的ED功能包括阻斷宿主mRNA的剪接、多聚腺苷酸化、抑制mRNA核轉(zhuǎn)運的細胞蛋白結(jié)合等。研究表明，CPSF與IFN-β非依賴性細胞抗病毒蛋白mRNA合成密切相關(guān)，宿主細胞內(nèi)CPSF可特異性地識別AAUAA序列，從而修飾mRNA，其中NS1蛋白的以186位氨基酸為中心的5個氨基酸殘基是其與CPSF30kDa亞基的結(jié)合位點[29]，當兩者相結(jié)合，宿主細胞內(nèi)的前體mRNA的生成受到抑制，進而抑制IFN-β的mRNA合成的數(shù)量[30]，抑制了宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。目前只解析了NS1-CPSF30復合物的晶體結(jié)構(gòu)。NS1蛋白的ED晶體學研究顯示，每個單體由7個β-鏈和3個α-螺旋組成[31,32]，且都可以獨立地進行二聚化，NS1蛋白除去少量loop區(qū)和羧基末端，大部分的二級結(jié)構(gòu)均相同[33,34]。研究表明，3條NS1長鏈二聚體形成一個螺旋狀管狀寡聚，而所有已知的效應(yīng)區(qū)配體結(jié)合位點全部暴露在寡聚體外表面，結(jié)合dsRNA的關(guān)鍵氨基酸位于中心通道的表面。NS1蛋白ED單體鏈折疊模式基本相同，但是二聚體相互作用界面結(jié)合模式差異很大，具體原因有待深入研究[35]。圖1.3NS1蛋白的結(jié)構(gòu)及其互作蛋白示意圖（Qian，2017）Figure1.3SchematicrepresentationoftheprimarystructureofNS1protein，togetherwithitsknowninteractionpartners（Qian，2017）
本文編號：3483062
【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
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【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
流感病毒的粒子結(jié)構(gòu)圖
第一篇文獻綜述A型流感病毒NS1蛋白研究進展4分開[13]。此外，NS1蛋白還具有2個核定位信號序列（nuclearlocalizationsequence，NLS）和1個核輸出信號（nuclearexportsignal，NES）兩個NLS分別位于RBD和ED，其中位于RBD的NLS由位于第35~41位氨基酸的RLRRDQK組成[14]，位于ED的NLS由位于第219~237位氨基酸的KRKMARTARSKVRRDKMAD組成，部分NS1蛋白由于C端的截短具有1個NLS，NES由位于第138~147位氨基酸的FDRLETLILL組成[15]。通過X射線衍射技術(shù)解析NS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，ED結(jié)構(gòu)域的3個β-折疊的整體平移，致使ED的作用界面發(fā)生變化，因此全長NS1蛋白晶體中，NS1蛋白并不是簡單的2個單體聚集構(gòu)成二聚體結(jié)構(gòu)，而是一個NS1單體的RBD和ED分別與另一個單體的RBD和ED相互作用產(chǎn)生交互式結(jié)合的鎖鏈二聚體結(jié)構(gòu)[16]，每3條二聚體又形成一個螺旋狀管狀寡聚[17]。下圖2008年對非結(jié)構(gòu)蛋白NS1X-衍射晶體結(jié)構(gòu)首次測定解析。圖1.2非結(jié)構(gòu)蛋白NS1X-衍射晶體結(jié)構(gòu)（Bornholdt,ZacharyA,Prasad,B.V，2008）Figure1.2X-raydiffractioncrystalstructureofnon-structuralproteinNS1（Bornholdt,ZacharyA,Prasad,B.V，2008）2.1NS1蛋白的RNA結(jié)合域NS1蛋白的RBD位于N末端，由3個α螺旋（分別是第1~30位氨基酸，第
第一篇文獻綜述A型流感病毒NS1蛋白研究進展6Ⅱ（Polyadenylatebindingprotein，PABII）結(jié)合時，宿主細胞的前體RNA受到抑制，3’端的修飾或細胞核內(nèi)poly(A)尾的延長受阻，進而抑制宿主自身mRNA的產(chǎn)生及核輸出（包括在抗病毒作用中發(fā)揮重要作用的IFN-β的mRNA）；除此之外，NS1蛋白還可與雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（double-strandedRNA-dependentproteinkinases，PKR）、p85β蛋白、TRIM25蛋白和一些PDZ結(jié)構(gòu)域的配體蛋白等相互作用，從而發(fā)揮不同的功能[28]。蛋白的ED功能包括阻斷宿主mRNA的剪接、多聚腺苷酸化、抑制mRNA核轉(zhuǎn)運的細胞蛋白結(jié)合等。研究表明，CPSF與IFN-β非依賴性細胞抗病毒蛋白mRNA合成密切相關(guān)，宿主細胞內(nèi)CPSF可特異性地識別AAUAA序列，從而修飾mRNA，其中NS1蛋白的以186位氨基酸為中心的5個氨基酸殘基是其與CPSF30kDa亞基的結(jié)合位點[29]，當兩者相結(jié)合，宿主細胞內(nèi)的前體mRNA的生成受到抑制，進而抑制IFN-β的mRNA合成的數(shù)量[30]，抑制了宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。目前只解析了NS1-CPSF30復合物的晶體結(jié)構(gòu)。NS1蛋白的ED晶體學研究顯示，每個單體由7個β-鏈和3個α-螺旋組成[31,32]，且都可以獨立地進行二聚化，NS1蛋白除去少量loop區(qū)和羧基末端，大部分的二級結(jié)構(gòu)均相同[33,34]。研究表明，3條NS1長鏈二聚體形成一個螺旋狀管狀寡聚，而所有已知的效應(yīng)區(qū)配體結(jié)合位點全部暴露在寡聚體外表面，結(jié)合dsRNA的關(guān)鍵氨基酸位于中心通道的表面。NS1蛋白ED單體鏈折疊模式基本相同，但是二聚體相互作用界面結(jié)合模式差異很大，具體原因有待深入研究[35]。圖1.3NS1蛋白的結(jié)構(gòu)及其互作蛋白示意圖（Qian，2017）Figure1.3SchematicrepresentationoftheprimarystructureofNS1protein，togetherwithitsknowninteractionpartners（Qian，2017）
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