發(fā)布時間：2021-11-06 20:48

　　在哺乳動物中,PPARγ能夠調控許多參與脂肪細胞分化和脂質代謝的基因,并且廣泛參與脂肪的吸收、運輸、生成和分解等,但在雞中關于該基因的研究還不夠深入。CRISPR/Cas9技術通過sgRNA特異性識別含有PAM的靶DNA序列,Cas9蛋白對靶序列進行切割,然后通過細胞DNA修復機制進行修復從而實現(xiàn)基因組的高效編輯。本研究主要利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞DF-1細胞系和原代前脂肪細胞PPARγ基因進行靶向敲除,從而為研究PPARγ基因在雞脂肪細胞分化中的作用和生產轉基因雞奠定基礎。1.為了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞DF-1細胞系和原代前脂肪細胞PPARγ基因進行靶向敲除,本研究在GenBank查找雞PPARγ的基因組序列后,通過麻省理工學院的http://crispr.Mit.edu軟件設計了1對sgRNA,成功構建了靶向PPARγ基因的pll3.7-U6-sgPPARγ-CMV-spCas9（sgPPARγ-Cas9）表達載體和pB-CMV-DsRed-CAG-PPARγ.200bp repeat.Puro-T2A-GFP（RPG-PPARγ）雙熒光報告載體。2.為了驗證... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 PPAR基因研究進展概述
        1.1.1 PPAR的類型和組織特異性表達
        1.1.2 PPARγ的結構和調控機制
        1.1.3 PPARγ在肥胖程度不同的個體中的表達規(guī)律
        1.1.4 PPARγ的配體
        1.1.5 PPARγ在脂肪形成的作用
        1.1.6 雞PPARγ的調控模式
    1.2 CRISPR/Cas9技術
        1.2.1 CRISPR/Cas的免疫獲得和分類
        1.2.2 CRISPR/Cas9的作用機理
        1.2.3 CRISPR/Cas9的應用
        1.2.4 CRISPR/Cas9的脫靶效應
    1.3 電穿孔轉染技術
    1.4 SSA-RPG篩選報告系統(tǒng)
    1.5 目的與意義
第二章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    2.1 試驗材料
        2.1.1 主要儀器設備
        2.1.2 主要試劑與試劑配置
        2.1.3 菌株和質粒
        2.1.4 引物序列
    2.2 試驗方法
        2.2.1 PPARγ靶位點的選擇
        2.2.2 CIRSPR-Cas9表達載體的構建
        2.2.3 RPG-PPARγ報告載體的構建
    2.3 試驗結果
        2.3.1 CIRSPR-Cas9表達載體的構建
        2.3.2 RPG報告載體的構建
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞DF1細胞系中PPARγ基因
    3.1 試驗材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑及試劑配制
        3.1.3 菌株，細胞系，質粒
    3.2 試驗方法
        3.2.1 DF-1 細胞的培養(yǎng)
        3.2.2 DF-1 細胞的轉染
        3.2.3 DF-1 陽性細胞的篩選與富集
        3.2.4 DF-1 細胞基因組水平的檢測
        3.2.5 脫靶檢測
    3.3 試驗結果
        3.3.1 載體水平的檢測
        3.3.2 陽性細胞的篩選與富集
        3.3.3 基因組水平的檢測
        3.3.4 脫靶檢測結果
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞前脂肪細胞中PPARγ基因
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗器材
        4.1.2 主要試劑及試劑配制
    4.2 試驗方法
        4.2.1 雞前脂肪細胞的分離和培養(yǎng)
        4.2.2 電穿孔法轉染雞前脂肪細胞
        4.2.3 前脂肪細胞嘌呤霉素的篩選
        4.2.4 前脂肪細胞基因組的檢測
    4.3 試驗結果
        4.3.1 前脂肪細胞的分離與培養(yǎng)
        4.3.2 CRISPR/Cas9在前脂肪細胞中報告載體水平的檢測
        4.3.3 陽性前脂肪細胞嘌呤霉素的篩選
        4.3.4 基因組水平檢測
    4.4 討論
        4.4.1 前脂肪細胞的轉染
        4.4.2 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞前脂肪細胞中PPARγ基因
    4.5 小結
結論和創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雞PPARγ基因的表達特性及其對脂肪細胞增殖分化的影響[J]. 王麗,那威,王宇祥,王彥博,王寧,王啟貴,李玉茂,李輝.  遺傳. 2012(04)

博士論文
[1]肉牛PPARs家族和PLIN基因遺傳變異及其與秦川牛胴體、肉質性狀相關分析[D]. 樊月圓.西北農林科技大學 2010



本文編號：3480500