在哺乳動(dòng)物中,PPARγ能夠調(diào)控許多參與脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的基因,并且廣泛參與脂肪的吸收、運(yùn)輸、生成和分解等,但在雞中關(guān)于該基因的研究還不夠深入。CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)sgRNA特異性識(shí)別含有PAM的靶DNA序列,Cas9蛋白對(duì)靶序列進(jìn)行切割,然后通過(guò)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)從而實(shí)現(xiàn)基因組的高效編輯。本研究主要利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)雞DF-1細(xì)胞系和原代前脂肪細(xì)胞PPARγ基因進(jìn)行靶向敲除,從而為研究PPARγ基因在雞脂肪細(xì)胞分化中的作用和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞奠定基礎(chǔ)。1.為了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)雞DF-1細(xì)胞系和原代前脂肪細(xì)胞PPARγ基因進(jìn)行靶向敲除,本研究在GenBank查找雞PPARγ的基因組序列后,通過(guò)麻省理工學(xué)院的http://crispr.Mit.edu軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)sgRNA,成功構(gòu)建了靶向PPARγ基因的pll3.7-U6-sgPPARγ-CMV-spCas9（sgPPARγ-Cas9）表達(dá)載體和pB-CMV-DsRed-CAG-PPARγ.200bp repeat.Puro-T2A-GFP（RPG-PPARγ）雙熒光報(bào)告載體。2.為了驗(yàn)證... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PPAR基因研究進(jìn)展概述
        1.1.1 PPAR的類(lèi)型和組織特異性表達(dá)
        1.1.2 PPARγ的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制
        1.1.3 PPARγ在肥胖程度不同的個(gè)體中的表達(dá)規(guī)律
        1.1.4 PPARγ的配體
        1.1.5 PPARγ在脂肪形成的作用
        1.1.6 雞PPARγ的調(diào)控模式
    1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)
        1.2.1 CRISPR/Cas的免疫獲得和分類(lèi)
        1.2.2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理
        1.2.3 CRISPR/Cas9的應(yīng)用
        1.2.4 CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)
    1.3 電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)
    1.4 SSA-RPG篩選報(bào)告系統(tǒng)
    1.5 目的與意義
第二章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 主要儀器設(shè)備
        2.1.2 主要試劑與試劑配置
        2.1.3 菌株和質(zhì)粒
        2.1.4 引物序列
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 PPARγ靶位點(diǎn)的選擇
        2.2.2 CIRSPR-Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 RPG-PPARγ報(bào)告載體的構(gòu)建
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 CIRSPR-Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 RPG報(bào)告載體的構(gòu)建
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞DF1細(xì)胞系中PPARγ基因
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑及試劑配制
        3.1.3 菌株，細(xì)胞系，質(zhì)粒
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 DF-1 細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.2 DF-1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.3 DF-1 陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與富集
        3.2.4 DF-1 細(xì)胞基因組水平的檢測(cè)
        3.2.5 脫靶檢測(cè)
    3.3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 載體水平的檢測(cè)
        3.3.2 陽(yáng)性細(xì)胞的篩選與富集
        3.3.3 基因組水平的檢測(cè)
        3.3.4 脫靶檢測(cè)結(jié)果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞前脂肪細(xì)胞中PPARγ基因
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 試驗(yàn)器材
        4.1.2 主要試劑及試劑配制
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 雞前脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
        4.2.2 電穿孔法轉(zhuǎn)染雞前脂肪細(xì)胞
        4.2.3 前脂肪細(xì)胞嘌呤霉素的篩選
        4.2.4 前脂肪細(xì)胞基因組的檢測(cè)
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 前脂肪細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
        4.3.2 CRISPR/Cas9在前脂肪細(xì)胞中報(bào)告載體水平的檢測(cè)
        4.3.3 陽(yáng)性前脂肪細(xì)胞嘌呤霉素的篩選
        4.3.4 基因組水平檢測(cè)
    4.4 討論
        4.4.1 前脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        4.4.2 利用CRIPSR/Cas9系統(tǒng)敲除雞前脂肪細(xì)胞中PPARγ基因
    4.5 小結(jié)
結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雞PPARγ基因的表達(dá)特性及其對(duì)脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[J]. 王麗,那威,王宇祥,王彥博,王寧,王啟貴,李玉茂,李輝.  遺傳. 2012(04)

博士論文
[1]肉牛PPARs家族和PLIN基因遺傳變異及其與秦川牛胴體、肉質(zhì)性狀相關(guān)分析[D]. 樊月圓.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3480500