本試驗旨在探究不同方法提取娟姍牛乳源性外泌體的優(yōu)缺點。采用差速超速離心法和試劑盒法2種提取方法對娟姍牛乳源性外泌體進行提取,通過透射電鏡（TEM）、Bradford蛋白定量、免疫印跡（WB）和粒徑分析（NTA）方法對2種提取方法得到的外泌體進行比較鑒定,并采用細胞毒性試驗對試劑盒法提取的外泌體進行細胞毒性評估。結(jié)果顯示:2種提取方法均獲得了茶托樣結(jié)構(gòu)的囊泡,但TEM視野下試劑盒法提取的外泌體較差速超速離心法多。試劑盒法提取的外泌體蛋白濃度顯著高于差速超速離心法（P<0.05）。2種提取方法均能夠檢測到外泌體的標(biāo)志性蛋白凋亡連接基因2相互作用蛋白X（ALIX）和四次跨膜蛋白（CD81）;差速超速離心法提取的外泌體CD81蛋白豐度極低,且并未鑒定出標(biāo)志性蛋白腫瘤敏感基因101蛋白（TSG101）,但試劑盒法檢測到了TSG101。2種提取方法得到的外泌體粒徑分布均符合外泌體的正常粒徑大�。�30～150 nm）。進一步通過細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn),試劑盒法提取的外泌體對細胞的增殖分化幾乎沒有影響。因此,基于本試驗條件下,試劑盒法更適用于提取娟姍牛乳源性外泌體。 

【文章來源】：動物營養(yǎng)學(xué)報. 2020,32(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

外泌體的粒徑檢測結(jié)果

從圖1可以看出，通過TEM方法分別對差速超速離心法及試劑盒法提取得到的外泌體進行了鑒定，2種提取方法得到的外泌體都拍到了典型的茶托樣結(jié)構(gòu)，電鏡下觀察到的囊泡大小在100 nm左右。圖1-A為差速超速離心法提取得到的外泌體，電鏡下觀察到的外泌體較少；圖1-B為試劑盒法提取得到的外泌體，電鏡下觀察到的外泌體較多。2.2 Bradford蛋白定量方法鑒定不同方法提取的娟姍牛乳源性外泌體的蛋白濃度

從圖3可以看出，通過對不同提取方法提取的外泌體的蛋白進行鑒定發(fā)現(xiàn)，圖3-A中差速超速離心法提取的蛋白條帶很雜，在相對蛋白分子量大的部分，蛋白條帶很弱，在相對蛋白分子量小的位置，條帶不規(guī)則；試劑盒法提取的各蛋白條帶都比較清晰，蛋白條帶也較多。通過WB方法對差速超速離心法和試劑盒法提取的外泌體進行了標(biāo)志性蛋白CD81、ALIX和TSG101的鑒定，結(jié)果顯示，2種提取方法均能夠檢測到外泌體的標(biāo)志性蛋白ALIX和CD81，但差速超速離心法提取的外泌體標(biāo)志性蛋白CD81蛋白豐度特別低，且并未鑒定出標(biāo)志性蛋白TSG101，但試劑盒法檢測到了標(biāo)志性蛋白TSG101,Calnexin作為外泌體陰性對照，2種提取方法均未檢測到Calnexin（圖3-B）。2.4 NTA方法鑒定不同方法提取的娟姍牛乳源性外泌體的粒徑

【參考文獻】：
期刊論文
[1]娟姍牛的雜交應(yīng)用研究進展[J]. 汪翔.  中國奶牛. 2016(09)
[2]不同品種原料乳理化特性分析[J]. 梁霄,劉鷺,張書文,孫琦,呂加平.  食品科學(xué). 2013(05)
[3]娟姍牛品種特性及適應(yīng)性飼養(yǎng)研究[J]. 王洋,于靜,王巍,張俊瑜,于清,王志明.  中國奶牛. 2011(11)



本文編號：3479393