豬圓環(huán)病毒病、豬乙型腦炎和豬細(xì)小病毒病均能引起豬的繁殖障礙，且目前多表現(xiàn)為混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是防控這三種傳染病的主要和有效措施，但市場上僅有商品化單苗。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展，豬場免疫接種工作量的加大，使用單苗進(jìn)行免疫費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,而且對動物造成很大應(yīng)激，影響免疫效果。因此，現(xiàn)代規(guī)�；B(yǎng)殖生產(chǎn)中，迫切需要能夠簡化免疫程序，一針多防的聯(lián)苗。本研究以研制豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細(xì)小病毒病三聯(lián)滅活疫苗為目標(biāo)，完成了以下研究工作：一．建立了基于PCV2Cap蛋白的間接ELISA方法。用PCR方法獲得截短的豬圓環(huán)病毒2型orf2基因，經(jīng)酶切后克隆至原核表達(dá)載體pET28a后，在終濃度為40μM IPTG，30℃下誘導(dǎo)表達(dá)3h后，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的基因得到正確表達(dá)，大小約為24KDa左右，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性表達(dá)為主；Western bloting檢測證實(shí)其具有免疫反應(yīng)活性。以純化的Cap蛋白為包被抗原，建立了檢測PCV2抗體的間接ELISA方法。建立的ELISA方法的最佳反應(yīng)條件是：抗原最適包被量為2μg/孔，包被時(shí)間為37℃包被1h后4℃過夜；血清... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

orf2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物及pET28a-orf2重組質(zhì)粒的雙酶切

圖 1-2 重組蛋白的 SDS-PAGE.SDS- PAGE analysis of the recombin40 μmol/L IPTG 誘導(dǎo)的 pET28a-orf2 T28a-orf2 菌體裂解上清;T28a-orf2 菌體裂解沉淀；ker;1: The pET28a-orf2 induced by IPTuced by IPTG of 40 μmol/L;3:The pern blotting 鑒定表達(dá)產(chǎn)物按照最優(yōu)條件進(jìn)行表達(dá)果如圖 1-3A 所示。將純化后的蛋一條特異性條帶（如圖 1-3B）。免疫反應(yīng)性。M 155KDaM

圖 1-2 重組蛋白的 SDS-PAGEFig 1-2.SDS- PAGE analysis of the recombinant proteinMarker; 1:40 μmol/L IPTG 誘導(dǎo)的 pET28a-orf2 菌體；導(dǎo)的 pET28a-orf2 菌體裂解上清;誘導(dǎo)的 pET28a-orf2 菌體裂解沉淀；ar low Marker;1: The pET28a-orf2 induced by IPTG of 40μmol/L;liquor induced by IPTG of 40 μmol/L;3:The precipition induced by I和 Western blotting 鑒定重組菌的表達(dá)產(chǎn)物按照最優(yōu)條件進(jìn)行表達(dá)后，收集菌體，超化，結(jié)果如圖 1-3A 所示。將純化后的蛋白進(jìn)行 Western blo右處可見一條特異性條帶（如圖 1-3B）。表明所表達(dá)蛋白為 P良好的免疫反應(yīng)性。KDaKDaM 155KDa40KDaM 1

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]乙型腦炎病毒貴州分離株E基因原核表達(dá)及其免疫原性的研究[J]. 湯德元,王鳳,馬萍,羅險(xiǎn)峰,李春燕,曾智勇,徐健,劉建.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(08)
[2]我國流行性乙型腦炎研究近況[J]. 蔡寶祥.  畜牧與獸醫(yī). 2012(07)
[3]豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2及其疫苗的研究進(jìn)展[J]. 焦茂興,郭春和,黃毓茂.  中國畜牧獸醫(yī). 2011(10)
[4]登革-日本腦炎嵌合病毒樣顆粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建[J]. 胡珍,尚偉龍,張俊磊,朱軍民,楊杰,劉佳,方昕,袁文常,程航,胡曉梅,饒賢才.  中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志. 2011(08)
[5]攜帶豬乙型腦炎DNA疫苗減毒沙門菌的構(gòu)建及其免疫原性[J]. 李云云,郭萬柱,徐志文,韓國全,林華,漆信橋.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(05)
[6]熒光定量PCR檢測豬圓環(huán)病毒2型方法的研究與應(yīng)用[J]. 李志娟,王永生,陳陸,楊霞,趙軍,王川慶.  揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2011(01)
[7]豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（SH株）—圓克清[J].   北方牧業(yè). 2010(23)
[8]豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG株）的研制與應(yīng)用[J]. 劉長明,危艷武,陸月華,黃立平,吳洪麗,張朝霞,溫士剛,姜鳳娟.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2010(09)
[9]PCV2 ORF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)及與PCV2滅活抗原免疫效果的比較[J]. 劉宗爭,尹遜河,欒文華,蘇賽.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2010(06)
[10]豬細(xì)小病毒分子生物學(xué)診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進(jìn)展[J]. 謝巧,李春華.  畜牧與獸醫(yī). 2010(02)

博士論文
[1]豬圓環(huán)病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及與豬細(xì)胞因子聯(lián)合免疫研究[D]. 張建遠(yuǎn).四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009

碩士論文
[1]豬偽狂犬病、細(xì)小病毒病和乙型腦炎三聯(lián)滅活疫苗的研制[D]. 何永龍.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[2]PPV-JEV二聯(lián)滅活苗和PPV-PRV二聯(lián)滅活苗的研制[D]. 黃剛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]豬細(xì)小病毒病、偽狂犬病和豬繁殖與呼吸綜合征三聯(lián)滅活疫苗的研制及田間試驗(yàn)[D]. 許家榮.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003



本文編號：3477732