豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus2, PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等相關(guān)疾病的主要病原。PMWS發(fā)病豬多為斷奶仔豬和育肥豬,表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸急促、厭食、黃疸、貧血、進(jìn)行性消瘦或生長遲緩等。隨著國際貿(mào)易交流的廣泛開展,PCV2在全球呈現(xiàn)出流行趨勢,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的影響,也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法對疾病的防控顯得十分重要。本研究制備了PCV2單克隆抗體,建立了捕獲ELISA抗體檢測方法,并與間接ELISA方法進(jìn)行了臨床應(yīng)用比較研究。PCV2單克隆抗體的制備：PCV2的ORF2基因編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（Cap）,也是區(qū)分PCV1與PCV2的重要區(qū)域,其編碼蛋白（Cap）具有良好的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)以Cap蛋白為抗原免疫6-8周齡的雌性Balb/C小鼠,將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,用間接ELISA方法篩選與亞克隆后共得到5株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2D3、3E10、1C5、3H11、4F9。將雜交瘤細(xì)胞對Balb/C小鼠進(jìn)行腹腔注射,收集腹水并用間接ELISA方法檢測腹水的抗體效價滴度... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展
        1.1.1 豬圓環(huán)病毒的病原學(xué)研究進(jìn)展
        1.1.2 豬圓環(huán)病毒2型的流行病學(xué)研究
        1.1.3 豬圓環(huán)病毒2型的致病機(jī)理研究
        1.1.4 豬圓環(huán)病毒2型的致病性
    1.2 豬圓環(huán)病毒2型檢測方法研究進(jìn)展
        1.2.1 抗原的檢測方法
        1.2.2 抗體的檢測方法
    1.3 豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體研究進(jìn)展
2 研究的目的及意義
3 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 抗原、血清、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動物
        3.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑
        3.1.3 主要溶液及其配制
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
    3.2 豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的制備
        3.2.1 單克隆抗體制備的技術(shù)流程
        3.2.2 抗原的制備及SDS-PAGE電泳
        3.2.3 動物免疫
        3.2.4 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的制備
        3.2.5 免疫脾細(xì)胞的制備
        3.2.6 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
        3.2.7 細(xì)胞融合
        3.2.8 間接ELISA方法篩選陽性克隆
        3.2.9 有限稀釋法亞克隆
        3.2.10 腹水的制備
        3.2.11 腹水抗體的純化
        3.2.12 單克隆抗體的Western Blot鑒定
    3.3 豬圓環(huán)病毒2型捕獲ELISA抗體檢測方法的建立
        3.3.1 捕獲ELISA程序
        3.3.2 包被抗體最佳濃度與捕獲抗原最佳濃度的確定
        3.3.3 捕獲抗原最佳溫育時間的確定
        3.3.4 按照已優(yōu)化的條件包被96孔酶標(biāo)板
        3.3.5 被檢血清最佳稀釋度的確定
        3.3.6 被檢血清最佳反應(yīng)時間的確定
        3.3.7 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
        3.3.8 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時間的確定
        3.3.9 臨界值的確定
        3.3.10 敏感性試驗(yàn)
        3.3.11 特異性試驗(yàn)
        3.3.12 重復(fù)性試驗(yàn)
    3.4 豬圓環(huán)病毒2型捕獲ELISA抗體檢測方法的臨床應(yīng)用
4 結(jié)果與分析
    4.1 豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的制備
        4.1.1 抗原的SDS-PAGE分析
        4.1.2 抗原的最佳包被濃度
        4.1.3 免疫小鼠抗體效價的測定
        4.1.4 細(xì)胞融合結(jié)果及亞克隆
        4.1.5 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價測定
        4.1.6 腹水效價的測定
        4.1.7 單克隆抗體的Western Blot鑒定
    4.2 豬圓環(huán)病毒2型捕獲ELISA抗體檢測方法的建立
        4.2.1 包被抗體最佳濃度與捕獲抗原最佳濃度的確定
        4.2.2 捕獲抗原最佳溫育時間的確定
        4.2.3 被檢血清最佳稀釋度的確定
        4.2.4 被檢血清最佳反應(yīng)時間的確定
        4.2.5 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
        4.2.6 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時間的確定
        4.2.7 臨界值的確定
        4.2.8 敏感性試驗(yàn)
        4.2.9 特異性試驗(yàn)
        4.2.10 重復(fù)性試驗(yàn)
    4.3 臨床血清檢測結(jié)果
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3469011