旨在使用轉(zhuǎn)座子插入突變方法構(gòu)建牛支原體08M株的突變體文庫,為毒力相關(guān)基因的鑒定提供技術(shù)平臺。測定了牛支原體08M株的濃度（顏色變化單位,CCU）和慶大霉素最低抑菌濃度（MIC）。應(yīng)用電穿孔方法,將慶大霉素抗性質(zhì)粒p ISM2062（攜帶有轉(zhuǎn)座子Tn4001mod）導(dǎo)入牛支原體08M株感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),經(jīng)抗性平板篩選、液體培養(yǎng)及PCR鑒定,構(gòu)建08M株的突變體文庫。隨機(jī)挑選10個克隆菌株傳10代檢測轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定性,挑選2個克隆用Southern blot檢測轉(zhuǎn)座子是否存在多次插入。結(jié)果顯示:08M株濃度為1.13×107CCU/m L,慶大霉素MIC為16 ng/μL;電轉(zhuǎn)化p ISM2062的牛支原體08M株在抗性平板形成菌落445個,從中克隆培養(yǎng)成功380個,PCR鑒定結(jié)果顯示存在Tn插入的菌株有263個,陽性率為69.21%（263/380）;插入的轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定傳代,且無多次插入。本研究成功初步構(gòu)建了牛支原體08M株的轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫。 

【文章來源】：畜牧與獸醫(yī). 2018,50(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

抗性平板上生長的菌落(100×)

裕?∮?0μg/mL的Gm作抗性篩選用。2.2電轉(zhuǎn)化試驗觀察37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d的平板上菌落生長情況。結(jié)果顯示，試驗組有菌落生長，但有的菌落生長不佳(圖1)�？剐云桨迳系膶φ战M沒有菌落生長，將對照組涂布在無抗性平板上的菌落進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果為1.46×108cfu/mL。使用一次性滅菌巴氏吸管共挑取試驗組菌落445個，置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果380個菌落生長，對生長菌落甘油保菌進(jìn)行后續(xù)測定。2.3PCＲ鑒定結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)化樣品及質(zhì)粒對照能夠擴(kuò)增到400bp特異性目的片段，野生型08M菌株P(guān)CＲ無目的片段(圖2)。共檢測得到263個陽性克隆，陽性率為69.21%(263/380)，根據(jù)對照組菌液涂無抗性平板后的菌落計數(shù)結(jié)果，計算出轉(zhuǎn)化效率為1.8×10－6(263/1.46×108)。圖1抗性平板上生長的菌落(100×)M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1－17.突變體樣品依次為A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062質(zhì)粒;19.08MDNA;20.ddH2O圖2牛支原體08M株轉(zhuǎn)化子DNA的PCＲ分析2.4穩(wěn)定性檢測挑取的陽性突變體連續(xù)傳10代后，PCＲ擴(kuò)增仍可檢測到400bp特異性目的片段，表明轉(zhuǎn)座子可穩(wěn)定存在于突變株中(圖3)。M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1－10.轉(zhuǎn)化株樣品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062質(zhì)粒;12.08MDNA;13.ddH2O圖3轉(zhuǎn)化株傳10代的PCＲ測定結(jié)果2.5轉(zhuǎn)化株Southernblot測定如圖4顯示，挑選的A347和A405轉(zhuǎn)化株在傳5代和10代后，未檢測到多次插入，表明轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)化株基因組中。2個雜交條帶分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型圖4轉(zhuǎn)化株Southernblot結(jié)果3討論牛支原體是引起肉牛和奶牛發(fā)病的一種重要病原·28·AnimalH

剮云槳逕仙?さ木??100×)M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1－17.突變體樣品依次為A304、A305、A307、A310～A323;18.pISM2062質(zhì)粒;19.08MDNA;20.ddH2O圖2牛支原體08M株轉(zhuǎn)化子DNA的PCＲ分析2.4穩(wěn)定性檢測挑取的陽性突變體連續(xù)傳10代后，PCＲ擴(kuò)增仍可檢測到400bp特異性目的片段，表明轉(zhuǎn)座子可穩(wěn)定存在于突變株中(圖3)。M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1－10.轉(zhuǎn)化株樣品(A027、A042、A044、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405);11.pISM2062質(zhì)粒;12.08MDNA;13.ddH2O圖3轉(zhuǎn)化株傳10代的PCＲ測定結(jié)果2.5轉(zhuǎn)化株Southernblot測定如圖4顯示，挑選的A347和A405轉(zhuǎn)化株在傳5代和10代后，未檢測到多次插入，表明轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)化株基因組中。2個雜交條帶分子量均在7500bp左右。M．DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1，A347(5代);2.A405(5代);3.A347(10代);4.A405(10代);5.08M野生型圖4轉(zhuǎn)化株Southernblot結(jié)果3討論牛支原體是引起肉牛和奶牛發(fā)病的一種重要病原·28·AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2018Vol.50No.5

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛支原體逃避宿主免疫的研究進(jìn)展[J]. 季文恒,儲岳峰,趙萍,陳勝利,郝華芳,王展慧,劉永生.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2017(03)
[2]4種抗原定量方法觀察牛支原體培養(yǎng)特征[J]. 王展慧,趙萍,陳勝利,郝華芳,秦明明,王紹偉,劉永生,儲岳峰.  中國畜牧獸醫(yī). 2016(10)
[3]肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷[J]. 石磊,龔瑞,尹爭艷,周勇,裴潔,胡智斌,王利霞,胡長敏,劉濤,陳穎鈺,廖娟紅,趙俊龍,陳煥春,郭愛珍.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2008(05)
[4]國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 辛九慶,李媛,郭丹,宋念華,胡守萍,陳超,裴潔,曹培麗.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2008(09)

博士論文
[1]牛支原體表達(dá)載體的構(gòu)建[D]. 李佳禾.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號：3464612