口蹄疫O型病毒3A和3B基因?qū)Σ《舅拗魇刃缘挠绊?/H1>
發(fā)布時(shí)間：2021-10-28 14:21
口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）非結(jié)構(gòu)蛋白3A基因的突變（點(diǎn)突變或缺失）和3B基因的拷貝數(shù)與病毒的宿主嗜性有關(guān),但FMDV宿主偏嗜性的分子機(jī)制目前還不明了。本研究選取口蹄疫M(jìn)ya-98譜系牛源分離株O/GZSB/2011和豬源分離株O/GD/2/CHN/2010,進(jìn)行了全基因組測(cè)序和全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了3A缺失突變體（rvSBA93-102、rvSBΔ133-143、rvGDA93-102和rvGDA133-143）3A嵌合病毒（rvSB70、rvOZ70和rvSBqO）、3A標(biāo)記病毒（rvSBm、rvSBh和vSBf）和3B突變體病毒（rvB1323、rv2B3、rvB13和rv1B3）,分析了這些重組病毒在不同宿主細(xì)胞上的生物學(xué)特性,結(jié)果表明：1、4株3A缺失突變體在BHK-21、PK-15和胎豬腎原代細(xì)胞（FPK）上具有與親本毒株相似的蝕斑表型和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；在胎牛腎原代細(xì)胞（FBK）上,rvSBA133-143和rvGDA133-143具有與其親本毒株相似的蝕斑表型和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué),而rvSBA93-102和...
【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市
【文章頁(yè)數(shù)】：130 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
1.1 口蹄疫病毒
1.2 FMD的歷史與分布
1.3 FMD在我國(guó)的流行現(xiàn)狀
1.3.1 A型
1.3.2 Asia 1型
1.3.3 O型
1.4 FMDV基因組結(jié)構(gòu)及其功能
1.4.1 FMDV非編碼區(qū)的功能
1.4.2 FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的功能
1.4.3 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能
1.5 反向遺傳學(xué)技術(shù)及其在RNA病毒中的應(yīng)用
1.5.1 反向遺傳學(xué)技術(shù)
1.5.2 反向遺傳學(xué)技術(shù)在RNA病毒中的應(yīng)用
1.5.3 RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的不足
1.6 3A與FMDV的宿主嗜性
1.7 研究?jī)?nèi)容和方法
第二章 兩株不同來(lái)源的口蹄疫病毒的全基因組序列測(cè)定及其基因特征分析
2.1 材料
2.1.1 病毒樣品
2.1.2 FMDV參考毒株
2.1.3 主要試劑
2.1.4 儀器設(shè)備
2.1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成
2.2 方法
2.2.1 病毒RNA的提取
2.2.2 反轉(zhuǎn)錄
2.2.3 FMDV基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增
2.2.4 PCR產(chǎn)物的純化回收及序列測(cè)定
2.2.5 序列分析
2.3 結(jié)果
2.3.1 RT-PCR
2.3.2 全基因組序列分析
2.3.3 序列比對(duì)分析
2.3.4 系統(tǒng)發(fā)生樹分析
2.4 討論
第三章 兩株口蹄疫病毒全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建
3.1 材料
3.1.1 病毒、質(zhì)粒、細(xì)胞
3.1.2 試劑
3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3.1.4 儀器設(shè)備
3.2 方法
3.2.1 引物設(shè)計(jì)
3.2.2 全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建
3.2.3 分子標(biāo)簽的引入
3.2.4 轉(zhuǎn)染
3.2.5 重組病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
3.2.6 間接免疫熒光檢測(cè)
3.2.7 生長(zhǎng)曲線分析
3.2.8 蝕斑形態(tài)分析
3.2.9 乳鼠毒價(jià)的測(cè)定
3.3 結(jié)果
3.3.1 FMDV全基因組序列的RT-PCR擴(kuò)增
3.3.2 融合PCR擴(kuò)增
3.3.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
3.3.4 分子標(biāo)簽的引入
3.3.5 重組質(zhì)粒的序列測(cè)定
3.3.6 重組病毒的拯救
3.3.7 重組病毒的RT-PCR檢測(cè)
3.3.8 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
3.3.9 間接免疫熒光檢測(cè)
3.3.10 生長(zhǎng)曲線分析
3.3.11 蝕斑表型分析
3.3.12 乳鼠致病力分析
3.4 討論
第四章 FMDV 3A缺失突變體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
4.1 材料
4.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
4.1.2 試劑
4.1.3 儀器設(shè)備
4.2 方法
4.2.1 引物設(shè)計(jì)
4.2.2 PCR擴(kuò)增
4.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
4.2.4 融合PCR
4.2.5 含3A缺失的FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
4.2.6 轉(zhuǎn)染
4.2.7 3A缺失突變體的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
4.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
4.2.9 生長(zhǎng)曲線分析
4.2.10 3A缺失突變體在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
4.2.11 熒光定量RT-PCR
4.2.12 乳鼠致病性試驗(yàn)
4.3 結(jié)果
4.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
4.3.2 融合PCR擴(kuò)增
4.3.3 含3A缺失的FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
4.3.4 3A缺失病毒的拯救
4.3.5 3A缺失病毒的RT-PCR檢測(cè)
4.3.6 3A缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
4.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
4.3.8 生長(zhǎng)曲線分析
4.3.9 蝕斑表型分析
4.3.10 熒光定量RT-PCR分析
4.4 討論
第五章 嵌合FMDV的構(gòu)建及其生物學(xué)特征
5.1 材料
5.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
5.1.2 試劑
5.1.3 儀器設(shè)備
5.2 方法
5.2.1 引物設(shè)計(jì)
5.2.2 PCR擴(kuò)增
5.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
5.2.4 融合PCR
5.2.5 嵌合FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
5.2.6 轉(zhuǎn)染
5.2.7 嵌合的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
5.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
5.2.9 生長(zhǎng)曲線分析
5.2.10 嵌合在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
5.2.11 熒光定量RT-PCR
5.3 結(jié)果
5.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
5.3.2 融合PCR擴(kuò)增
5.3.3 嵌合FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
5.3.4 嵌合病毒的拯救
5.3.5 嵌合病毒的RT-PCR檢測(cè)
5.3.6 嵌合病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
5.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
5.3.8 生長(zhǎng)曲線分析
5.3.9 蝕斑表型分析
5.3.10 熒光定量RT-PCR分析
5.4 討論
第六章 3A標(biāo)記的FMDV的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析
6.1 材料
6.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
6.1.2 試劑
6.1.3 儀器設(shè)備
6.2 方法
6.2.1 引物設(shè)計(jì)
6.2.2 PCR擴(kuò)增
6.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
6.2.4 融合PCR
6.2.5 3A標(biāo)記的FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
6.2.6 轉(zhuǎn)染
6.2.7 3A標(biāo)記病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
6.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
6.2.9 Western blot檢測(cè)
6.2.10 生長(zhǎng)曲線分析
6.2.11 3A標(biāo)記病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
6.3 結(jié)果
6.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
6.3.2 融合PCR擴(kuò)增
6.3.3 3A標(biāo)記的FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
6.3.4 3A標(biāo)記病毒的拯救
6.3.5 3A標(biāo)記病毒的RT-PCR檢測(cè)
6.3.6 3A缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
6.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
6.3.8 Western blot分析
6.3.9 生長(zhǎng)曲線分析
6.3.10 蝕斑表型分析
6.4 討論
第七章 FMDV 3B突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析
7.1 材料
7.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
7.1.2試劑
7.1.3 儀器設(shè)備
7.2 方法
7.2.1 引物設(shè)計(jì)
7.2.2 PCR擴(kuò)增
7.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
7.2.4 融合PCR
7.2.5 PCR擴(kuò)增
7.2.6 融合PCR
7.2.7 3B突變體FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
7.2.8 轉(zhuǎn)染
7.2.9 3B突變體病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
7.2.10 間接免疫熒光檢測(cè)
7.2.11 Western blot檢測(cè)
7.2.12 生長(zhǎng)曲線分析
7.2.13 3B突變體病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
7.3 結(jié)果
7.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
7.3.2 融合PCR擴(kuò)增
7.3.3 3B突變體FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
7.3.4 3B突變體病毒的拯救
7.3.5 3B突變體病毒的RT-PCR檢測(cè)
7.3.6 3B突變體病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
7.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
7.3.8 Western blot分析
7.3.9 生長(zhǎng)曲線分析
7.3.10 蝕斑表型分析
7.4 討論
第八章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RDD基序?qū)谔阋逜sia1型毒株感染力的影響[J]. 鄭海學(xué),郭建宏,靳野,尚佑軍,田宏,楊亞民,劉湘濤,才學(xué)鵬. 科學(xué)通報(bào). 2010(14)
[2]牛Asia 1型口蹄疫病毒感染性克隆的構(gòu)建[J]. 李爽,張潤(rùn)祥,宋鴿,高明春,劉湘濤,王君偉. 生物工程學(xué)報(bào). 2009(11)
[3]RNA病毒作為疫苗載體的研究與應(yīng)用[J]. 胡偉,段海清,陳惠鵬. 生物技術(shù)通訊. 2007(03)
本文編號(hào)：3462933
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/dongwuyixue/3462933.html
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【文章頁(yè)數(shù)】：130 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
1.1 口蹄疫病毒
1.2 FMD的歷史與分布
1.3 FMD在我國(guó)的流行現(xiàn)狀
1.3.1 A型
1.3.2 Asia 1型
1.3.3 O型
1.4 FMDV基因組結(jié)構(gòu)及其功能
1.4.1 FMDV非編碼區(qū)的功能
1.4.2 FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的功能
1.4.3 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能
1.5 反向遺傳學(xué)技術(shù)及其在RNA病毒中的應(yīng)用
1.5.1 反向遺傳學(xué)技術(shù)
1.5.2 反向遺傳學(xué)技術(shù)在RNA病毒中的應(yīng)用
1.5.3 RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的不足
1.6 3A與FMDV的宿主嗜性
1.7 研究?jī)?nèi)容和方法
第二章 兩株不同來(lái)源的口蹄疫病毒的全基因組序列測(cè)定及其基因特征分析
2.1 材料
2.1.1 病毒樣品
2.1.2 FMDV參考毒株
2.1.3 主要試劑
2.1.4 儀器設(shè)備
2.1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成
2.2 方法
2.2.1 病毒RNA的提取
2.2.2 反轉(zhuǎn)錄
2.2.3 FMDV基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增
2.2.4 PCR產(chǎn)物的純化回收及序列測(cè)定
2.2.5 序列分析
2.3 結(jié)果
2.3.1 RT-PCR
2.3.2 全基因組序列分析
2.3.3 序列比對(duì)分析
2.3.4 系統(tǒng)發(fā)生樹分析
2.4 討論
第三章 兩株口蹄疫病毒全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的構(gòu)建
3.1 材料
3.1.1 病毒、質(zhì)粒、細(xì)胞
3.1.2 試劑
3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3.1.4 儀器設(shè)備
3.2 方法
3.2.1 引物設(shè)計(jì)
3.2.2 全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建
3.2.3 分子標(biāo)簽的引入
3.2.4 轉(zhuǎn)染
3.2.5 重組病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
3.2.6 間接免疫熒光檢測(cè)
3.2.7 生長(zhǎng)曲線分析
3.2.8 蝕斑形態(tài)分析
3.2.9 乳鼠毒價(jià)的測(cè)定
3.3 結(jié)果
3.3.1 FMDV全基因組序列的RT-PCR擴(kuò)增
3.3.2 融合PCR擴(kuò)增
3.3.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
3.3.4 分子標(biāo)簽的引入
3.3.5 重組質(zhì)粒的序列測(cè)定
3.3.6 重組病毒的拯救
3.3.7 重組病毒的RT-PCR檢測(cè)
3.3.8 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
3.3.9 間接免疫熒光檢測(cè)
3.3.10 生長(zhǎng)曲線分析
3.3.11 蝕斑表型分析
3.3.12 乳鼠致病力分析
3.4 討論
第四章 FMDV 3A缺失突變體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
4.1 材料
4.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
4.1.2 試劑
4.1.3 儀器設(shè)備
4.2 方法
4.2.1 引物設(shè)計(jì)
4.2.2 PCR擴(kuò)增
4.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
4.2.4 融合PCR
4.2.5 含3A缺失的FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
4.2.6 轉(zhuǎn)染
4.2.7 3A缺失突變體的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
4.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
4.2.9 生長(zhǎng)曲線分析
4.2.10 3A缺失突變體在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
4.2.11 熒光定量RT-PCR
4.2.12 乳鼠致病性試驗(yàn)
4.3 結(jié)果
4.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
4.3.2 融合PCR擴(kuò)增
4.3.3 含3A缺失的FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
4.3.4 3A缺失病毒的拯救
4.3.5 3A缺失病毒的RT-PCR檢測(cè)
4.3.6 3A缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
4.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
4.3.8 生長(zhǎng)曲線分析
4.3.9 蝕斑表型分析
4.3.10 熒光定量RT-PCR分析
4.4 討論
第五章 嵌合FMDV的構(gòu)建及其生物學(xué)特征
5.1 材料
5.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
5.1.2 試劑
5.1.3 儀器設(shè)備
5.2 方法
5.2.1 引物設(shè)計(jì)
5.2.2 PCR擴(kuò)增
5.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
5.2.4 融合PCR
5.2.5 嵌合FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
5.2.6 轉(zhuǎn)染
5.2.7 嵌合的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
5.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
5.2.9 生長(zhǎng)曲線分析
5.2.10 嵌合在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
5.2.11 熒光定量RT-PCR
5.3 結(jié)果
5.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
5.3.2 融合PCR擴(kuò)增
5.3.3 嵌合FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
5.3.4 嵌合病毒的拯救
5.3.5 嵌合病毒的RT-PCR檢測(cè)
5.3.6 嵌合病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
5.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
5.3.8 生長(zhǎng)曲線分析
5.3.9 蝕斑表型分析
5.3.10 熒光定量RT-PCR分析
5.4 討論
第六章 3A標(biāo)記的FMDV的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析
6.1 材料
6.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
6.1.2 試劑
6.1.3 儀器設(shè)備
6.2 方法
6.2.1 引物設(shè)計(jì)
6.2.2 PCR擴(kuò)增
6.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
6.2.4 融合PCR
6.2.5 3A標(biāo)記的FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
6.2.6 轉(zhuǎn)染
6.2.7 3A標(biāo)記病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
6.2.8 間接免疫熒光檢測(cè)
6.2.9 Western blot檢測(cè)
6.2.10 生長(zhǎng)曲線分析
6.2.11 3A標(biāo)記病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
6.3 結(jié)果
6.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
6.3.2 融合PCR擴(kuò)增
6.3.3 3A標(biāo)記的FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
6.3.4 3A標(biāo)記病毒的拯救
6.3.5 3A標(biāo)記病毒的RT-PCR檢測(cè)
6.3.6 3A缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
6.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
6.3.8 Western blot分析
6.3.9 生長(zhǎng)曲線分析
6.3.10 蝕斑表型分析
6.4 討論
第七章 FMDV 3B突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析
7.1 材料
7.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
7.1.2試劑
7.1.3 儀器設(shè)備
7.2 方法
7.2.1 引物設(shè)計(jì)
7.2.2 PCR擴(kuò)增
7.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
7.2.4 融合PCR
7.2.5 PCR擴(kuò)增
7.2.6 融合PCR
7.2.7 3B突變體FMDV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建
7.2.8 轉(zhuǎn)染
7.2.9 3B突變體病毒的RT-PCR鑒定及穩(wěn)定性分析
7.2.10 間接免疫熒光檢測(cè)
7.2.11 Western blot檢測(cè)
7.2.12 生長(zhǎng)曲線分析
7.2.13 3B突變體病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力和蝕斑表型分析
7.3 結(jié)果
7.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
7.3.2 融合PCR擴(kuò)增
7.3.3 3B突變體FMDV全長(zhǎng)cDNA的鑒定
7.3.4 3B突變體病毒的拯救
7.3.5 3B突變體病毒的RT-PCR檢測(cè)
7.3.6 3B突變體病毒的遺傳穩(wěn)定性分析
7.3.7 間接免疫熒光檢測(cè)
7.3.8 Western blot分析
7.3.9 生長(zhǎng)曲線分析
7.3.10 蝕斑表型分析
7.4 討論
第八章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RDD基序?qū)谔阋逜sia1型毒株感染力的影響[J]. 鄭海學(xué),郭建宏,靳野,尚佑軍,田宏,楊亞民,劉湘濤,才學(xué)鵬. 科學(xué)通報(bào). 2010(14)
[2]牛Asia 1型口蹄疫病毒感染性克隆的構(gòu)建[J]. 李爽,張潤(rùn)祥,宋鴿,高明春,劉湘濤,王君偉. 生物工程學(xué)報(bào). 2009(11)
[3]RNA病毒作為疫苗載體的研究與應(yīng)用[J]. 胡偉,段海清,陳惠鵬. 生物技術(shù)通訊. 2007(03)
本文編號(hào)：3462933
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