豬流感（swine influenza, SI）是由豬流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的一種急性、傳染性和群發(fā)性呼吸道疾病。NS1（non-structural1）蛋白是病毒重要的調(diào)控蛋白,是病毒感染期間重要的毒力因子,通過多種機制抵抗宿主抗病毒應(yīng)答。對NS1蛋白的研究發(fā)現(xiàn),NS1蛋白影響宿主免疫系統(tǒng)的功能,與NS1蛋白上的特定氨基酸位點密切相關(guān)。本研究擬對NS1關(guān)鍵氨基酸位點進行突變,分析表達蛋白對細胞內(nèi)干擾素（IFN-α/β）和腫瘤壞死因子（TNF-a）的影響,進一步明確NS1抑制干擾素產(chǎn)生機理,為防治豬流感提供理論依據(jù)。研究擴增了豬流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007（H1N2）分離株NS1基因,克隆到pCAGGS表達載體,構(gòu)建重組表達載體pCAGGS-NS1,經(jīng)PCR和酶切鑒定,獲得陽性克隆,序列分析表明NS1基因序列正確,無突變。設(shè)計引物,分別對42、92、42/92位氨基酸進行突變,構(gòu)建了pCAGGS-NS1S42P, pCAGGS-NS1D92E pCAGGS-NS1S42P/D92E重組表達載體。提取pCAGGS-N... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文獻綜述
    第一章 豬流感病毒NS1蛋白的研究進展
        1 豬流感概述
        2 豬流感病毒編碼的蛋白特性
        3 NS1蛋白結(jié)構(gòu)和功能
            3.1 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)特征
            3.2 NS1蛋白的功能
                3.2.1 NS1蛋白抑制宿主細胞蛋白的合成
                3.2.2 NS1蛋白促進病毒蛋白的合成與表達
                3.2.3 NS1蛋白頡頏干擾素及腫瘤壞死因子
                3.2.4 NS1蛋白影響宿主細胞凋亡
            3.3 NS1蛋白對流感病毒致病性和毒力的影響
                3.3.2 NS1蛋白與病毒致病性
                3.3.3 NS1蛋白與病毒毒力
        4 NS1蛋白的應(yīng)用
            4.1 NS1蛋白在鑒別診斷中的應(yīng)用
            4.2 NS1蛋白作為抗病毒治療的靶點
            4.3 NS1基因突變重組病毒對腫瘤的治療
            4.4 針對NS1蛋白設(shè)計新型疫苗
    參考文獻
第二篇 試驗研究
    第二章 豬流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1蛋白關(guān)鍵氨基酸位點對細胞定位的影響
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 NS1及其突變體真核表達載體的構(gòu)建
                    1.2.1.1 引物設(shè)計
                    1.2.1.2 目的基因擴增與回收
                    1.2.1.3 真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                    1.2.1.4 重組質(zhì)粒的制備、鑒定及定量
                1.2.2 脂質(zhì)體Lipofectamine~(TM) 2000介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染細胞
                1.2.3 Westen blot鑒定NS1重組蛋白的表達
                1.2.4 間接免疫熒光技術(shù)分析NS1及其突變體蛋白的細胞定位
                1.2.5 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用
        2 結(jié)果
            2.1 NS1及其突變體真核表達載體的構(gòu)建
            2.2 Westen blot檢測NS1及NS1突變體蛋白
            2.3 NS1及NS1突變體蛋白在真核細胞中的定位分析
            2.4 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用
        3 討論
        參考文獻
        Abstract
    第三章 豬流感病毒NS1蛋白關(guān)鍵氨基酸位點對細胞因子影響
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 脂質(zhì)體Lipofectamine~(TM)2000介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染細胞
                1.2.2 IFN-α/β和TNF-α分析
                    1.2.2.1 提取細胞總RNA
                    1.2.2.2 RT-PCR擴增IFN-α/β和TNF-α基因
                    1.2.2.3 ELISA檢測IFN-α/β和TNF-α蛋白表達水平
        2 結(jié)果
            2.1 IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平
            2.2 IFN-α/β和TNF-α ELISA檢測
        3 討論
        參考文獻
        Abstract
    第四章 不同毒株NS1蛋白對細胞IFN-α/β和TNF-α表達的影響
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 病毒、細胞及實驗小鼠
                1.1.2 主要試劑和儀器
            1.2 方法
                1.2.1 ELISA試劑盒檢測IFN-α/β和TNF-α蛋白
                1.2.2 BALB/c小鼠免疫及分組
                1.2.3 小鼠淋巴細胞分離
                1.2.4 流式細胞儀測定T細胞亞群
        2 結(jié)果
            2.1 IFN-α/β和TNF-α ELISA檢測結(jié)果
            2.2 流式細胞儀測定T細胞亞群
        3 討論
        參考文獻
        Abstract
全文總結(jié)
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3461832