長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類具有多種功能的RNA分子,參與調(diào)控機(jī)體的生命活動。近期研究結(jié)果顯示,在病毒感染的組織或細(xì)胞中l(wèi)ncRNA差異表達(dá)。目前,有關(guān)人類的lncRNA研究較多,而在動物體上的研究相對較少。本研究旨在分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染宿主細(xì)胞后lncRNA表達(dá)譜的變化以及差異表達(dá)的lncRNA對PEDV及宿主的調(diào)節(jié)功能。首先,為探究PEDV感染是否影響宿主lncRNA的表達(dá)水平,本研究對感染PEDV的豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2細(xì)胞）樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析,分析結(jié)果表明,PEDV可誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞中的lncRNA發(fā)生差異表達(dá),且其表達(dá)水平隨PEDV感染時間推移呈現(xiàn)不同倍數(shù)的增多或減少;采用基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）對差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行功能富集,發(fā)現(xiàn)在PEDV感染后的不同時間點(diǎn)宿主lncRNA所富集的信號通路不盡相同,這表明宿主的主要生命過程隨病毒感染的時間推移呈現(xiàn)動態(tài)變化。通過靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)lncRNA-9560和lncRNA-9606靶向同一個轉(zhuǎn)錄本,而該轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)與IgA生成密切相關(guān)。... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

長鏈非編碼RNA基于其基因序列與編碼蛋白質(zhì)的基因的相對位置的分類Fig.1-1CurrentclassificationoflongnoncodingRNAs(lncRNAs)basedonthepositionalrelationshipbetween

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞lncRNA的轉(zhuǎn)錄組分析9(2)在EP管中加入RNAisoPlus的1/5體積量的三氯甲烷，劇烈震蕩直至溶液由清亮變渾濁，室溫靜置10min。(3)于4℃12000g離心15min，此時溶液分為三層，上層水相中含RNA，下層酚相含DNA，中間的是蛋白質(zhì)，吸取水相至新的EP管中。(4)加入異丙醇(RNAisoPlus的1/2體積量)，室溫沉淀RNA10min后，于4℃12000g離心15min。(5)用1mL的75%的無水乙醇清洗沉淀，于4℃7500g離心5min，棄上清，加入無酶水溶解沉淀。(6)使用超微量分光光度計(jì)分析RNA樣品的質(zhì)量：主要檢測A260/A280及A230/260比值。2.2.4.3RNA-seq文庫構(gòu)建及測序使用Ribo-ZerorRNAremovalKit去除總RNA中的核糖體RNA(rRNA)，使用RNA斷裂試劑將RNA隨機(jī)打斷為200-500nt的短片段，以短片段為模板，用ProtoScriptII反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物和ActinomycinD合成第一鏈cDNA，再加入第二鏈合成酶試劑盒(含dACG-TP/dUTP)合成第二鏈cDNA。用QiaQuickPCR試劑盒純化雙鏈cDNA，EB緩沖液洗脫，進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A和測序接頭，采用UNG酶降解第二條鏈cDNA，最后用瓊脂糖凝膠電泳選擇片段大小，PCR擴(kuò)增，采用IlluminaHiSeqTM4000對建好的cDNA文庫進(jìn)行測序，cDNA文庫構(gòu)建示意圖2-1所示：圖2-1cDNA文庫構(gòu)建示意圖Fig.2-1ConstructiondiagramofcDNAlibrary

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞lncRNA的轉(zhuǎn)錄組分析11圖2-2樣品堿基位置質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布Fig.2-2MassdistributionofbasepositionsofsequencingsamplesA-F分別為Mock36h，60h，72h和PEDV感染36h，60h，72h樣品的堿基位置質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布情況通過分析樣品的堿基序列平均質(zhì)量分布，判斷測序質(zhì)量，下圖(圖2-3)中X軸表示序列平均堿基質(zhì)量值，Y軸是序列數(shù)量，當(dāng)大部分堿基序列的平均質(zhì)量值峰值大于30時，可以判斷序列質(zhì)量較好。由下圖可知，六組RNA樣品中的大部分堿基序列的平均質(zhì)量值峰值均高于30，約為40左右，表明這六組樣品的堿基序列平均質(zhì)量較好。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]長鏈非編碼RNA lncATV參與宿主抗病毒機(jī)制的研究[D]. 凡靜靜.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2018

碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用[D]. 王玄珂.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號：3459843