發(fā)布時(shí)間：2021-10-24 18:37

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種病毒性傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV是一種對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）具有強(qiáng)親嗜性的單股正鏈RNA病毒。首株P(guān)RRSV就是從PAM上分離獲得的。PAM被認(rèn)為是急性感染期病毒復(fù)制的主要位點(diǎn),也是肺部最早接觸病原微生物的免疫防御細(xì)胞之一。miRNA是轉(zhuǎn)錄后起調(diào)控作用的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA,通過(guò)與靶基因的3’-UTR結(jié)合,抑制靶基因的翻譯或者導(dǎo)致其降解,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控作用。越來(lái)越多的研究表明miRNA在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化、非特異性免疫、特異性免疫應(yīng)答及疾病發(fā)展中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究以皮特蘭和清平豬PAM感染PRRSV后的早、中、晚三個(gè)時(shí)期（9h、36h、60h）為研究對(duì)象,并以同時(shí)間點(diǎn)未感染PRRSV的PAM為對(duì)照,構(gòu)建了12個(gè)miRNA文庫(kù)。利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)12個(gè)miRNA文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序分析,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,取得了如下結(jié)果：（1）在皮特蘭和清平豬PAM中分別獲得97,729,281和83,323,798條原始小RNA序列。通過(guò)去除接頭、污染... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬繁殖與呼吸綜合征
    2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學(xué)特征
    3 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)
    4 miRNA功能和研究進(jìn)展
        4.1 miRNA的生物合成過(guò)程
        4.2 miRNA的作用機(jī)制
        4.3 miRNA的研究方法
        4.4 miRNA在免疫應(yīng)答和抗病毒方面的功能研究
            4.4.1 miRNA在免疫應(yīng)答中的作用
            4.4.2 miRNA在病毒感染中的作用
    5 研究目的和意義
第二章 材料和方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞、毒株
        1.2 載體和菌株
        1.3 試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備
        1.4 試驗(yàn)主要藥品和試劑
        1.5 試驗(yàn)緩沖液和常用試劑的配制
        1.6 主要數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 仔豬的選擇及抗體的檢測(cè)
        2.2 PAM的分離及病毒檢測(cè)
            2.2.1 PAM的分離
            2.2.2 細(xì)胞液RNA的提取
            2.2.3 RNA濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)
            2.2.4 cDNA的合成
            2.2.5 PRRSV抗原檢測(cè)
        2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.4 PRRSV的增殖
        2.5 PRRSV半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)的測(cè)定
        2.6 不同豬種PRRSV易感性實(shí)驗(yàn)
            2.6.1 PAM細(xì)胞的收集
            2.6.2 絕對(duì)熒光定量PCR繪制不同豬種病毒復(fù)制曲線(xiàn)
        2.7 高通量測(cè)序樣品的準(zhǔn)備
            2.7.1 PAM的培養(yǎng)和處理
            2.7.2 細(xì)胞總RNA的提取
            2.7.3 RNA濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)
        2.8 Solexa上樣測(cè)序、數(shù)據(jù)的產(chǎn)生及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析
            2.8.1 生物信息學(xué)分析流程
            2.8.2 基本生物信息學(xué)分析
            2.8.3 高級(jí)生物信息學(xué)分析
        2.9 候選miRNAs的驗(yàn)證
            2.9.1 總RNA去除基因組污染
            2.9.2 莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成
            2.9.3 cDNA檢測(cè)
            2.9.4 miRNAs成熟序列的擴(kuò)增引物及莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄特異引物的設(shè)計(jì)
            2.9.5 miRNAs成熟序列的擴(kuò)增
            2.9.6 miRNAs成熟序列的克隆鑒定
            2.9.7 實(shí)時(shí)定量法對(duì)miRNAs的驗(yàn)證
        2.10 半定量法檢測(cè)miRNA組織表達(dá)譜
            2.10.1 大白豬各組織樣總RNA的提取
            2.10.2 cDNA的合成
            2.10.3 miRNA組織表達(dá)譜分析
        2.11 miR-210靶基因驗(yàn)證
            2.11.1 靶基因MX13'UTR的擴(kuò)增
            2.11.2 pMD18-T片段質(zhì)粒的雙酶切及缺失片段的回收
            2.11.3 pmirGLO載體的構(gòu)建
            2.11.4 pmirGLO質(zhì)粒的中量提取
            2.11.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.11.6 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)
第三章 結(jié)果與分析
    1 PAM細(xì)胞PRRSV檢測(cè)
    2 不同豬種PRRSV易感性試驗(yàn)
        2.2 QORF7重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
        2.3 不同品種豬PRRSV動(dòng)力復(fù)制曲線(xiàn)
    3 測(cè)序樣品RNA質(zhì)量分析
    4 Solexa文庫(kù)測(cè)序及生物信息學(xué)分析
        4.1 皮特蘭測(cè)序結(jié)果分析
            4.1.1 Solexa文庫(kù)概述
            4.1.2 Small RNA長(zhǎng)度分布
            4.1.3 小RNA分類(lèi)注釋
            4.1.4 miRNAs的堿基分布特征
            4.1.5 已知miRNA分析
            4.1.6 候選miRNA預(yù)測(cè)
            4.1.7 已知miRNA差異分析
            4.1.8 miRNA靶基因位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            4.1.9 靶基因的功能注釋
        4.2 清平測(cè)序結(jié)果分析
            4.2.1 Solexa文庫(kù)概述
            4.2.2 Small RNA長(zhǎng)度分布
            4.2.3 小RNA分類(lèi)注釋
            4.2.4 小RNA與重復(fù)序列比對(duì)結(jié)果
            4.2.5 已知miRNA分析
            4.2.6 已知miRNA“種子”區(qū)序列堿基編輯
            4.2.7 候選miRNA預(yù)測(cè)
            4.2.8 已知miRNA差異表達(dá)分析
    5 miRNAs實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析驗(yàn)證
        5.1 RNA的提取
        5.2 cDNA檢測(cè)結(jié)果
        5.3 miRNAs成熟序列的擴(kuò)增
        5.4 miRNAs的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果
    6 miRNAs在豬中不同組織中的表達(dá)結(jié)果
    7 MX1雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建結(jié)果
        7.1 MX1 3'UTR序列的擴(kuò)增
        7.2 pmirGLO MX1 3'UTR重組質(zhì)粒的鑒定
        7.3 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果
第四章 討論
    1 試驗(yàn)樣品的選擇
    2 檢測(cè)方法和測(cè)序質(zhì)量
    3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)
    4 miRNA表達(dá)分析
        4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA
        4.2 差異miRNA實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證
第五章 小結(jié)
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 下一步工作
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNA-124靶標(biāo)功能的生物信息學(xué)挖掘[J]. 魏強(qiáng),李廣林,郭韜.  生命科學(xué)研究. 2010(05)
[2]豬無(wú)名高熱綜合癥[J]. 萬(wàn)遂如.  養(yǎng)殖與飼料. 2006(10)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征及其在我國(guó)的現(xiàn)狀與對(duì)策[J]. 蔡雪暉,柴文君,翁長(zhǎng)江,劉光清,郭寶清.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(S1)
[4]MxA抗病毒蛋白的研究進(jìn)展[J]. 楊吉成.  蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2000(06)
[5]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國(guó)畜禽傳染病. 1996(02)



本文編號(hào)：3455779