發(fā)布時間：2021-10-24 18:37

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種病毒性傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害和經(jīng)濟損失。PRRSV是一種對肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）具有強親嗜性的單股正鏈RNA病毒。首株P(guān)RRSV就是從PAM上分離獲得的。PAM被認(rèn)為是急性感染期病毒復(fù)制的主要位點,也是肺部最早接觸病原微生物的免疫防御細(xì)胞之一。miRNA是轉(zhuǎn)錄后起調(diào)控作用的一類內(nèi)源性非編碼小RNA,通過與靶基因的3’-UTR結(jié)合,抑制靶基因的翻譯或者導(dǎo)致其降解,從而實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控作用。越來越多的研究表明miRNA在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化、非特異性免疫、特異性免疫應(yīng)答及疾病發(fā)展中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究以皮特蘭和清平豬PAM感染PRRSV后的早、中、晚三個時期（9h、36h、60h）為研究對象,并以同時間點未感染PRRSV的PAM為對照,構(gòu)建了12個miRNA文庫。利用Solexa高通量測序技術(shù)對12個miRNA文庫進行了測序分析,并通過實驗對測序結(jié)果進行驗證,取得了如下結(jié)果：（1）在皮特蘭和清平豬PAM中分別獲得97,729,281和83,323,798條原始小RNA序列。通過去除接頭、污染... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬繁殖與呼吸綜合征
    2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子生物學(xué)特征
    3 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)
    4 miRNA功能和研究進展
        4.1 miRNA的生物合成過程
        4.2 miRNA的作用機制
        4.3 miRNA的研究方法
        4.4 miRNA在免疫應(yīng)答和抗病毒方面的功能研究
            4.4.1 miRNA在免疫應(yīng)答中的作用
            4.4.2 miRNA在病毒感染中的作用
    5 研究目的和意義
第二章 材料和方法
    1 試驗材料
        1.1 細(xì)胞、毒株
        1.2 載體和菌株
        1.3 試驗主要儀器和設(shè)備
        1.4 試驗主要藥品和試劑
        1.5 試驗緩沖液和常用試劑的配制
        1.6 主要數(shù)據(jù)庫和軟件
    2 試驗方法
        2.1 仔豬的選擇及抗體的檢測
        2.2 PAM的分離及病毒檢測
            2.2.1 PAM的分離
            2.2.2 細(xì)胞液RNA的提取
            2.2.3 RNA濃度測定和質(zhì)量檢測
            2.2.4 cDNA的合成
            2.2.5 PRRSV抗原檢測
        2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.4 PRRSV的增殖
        2.5 PRRSV半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)的測定
        2.6 不同豬種PRRSV易感性實驗
            2.6.1 PAM細(xì)胞的收集
            2.6.2 絕對熒光定量PCR繪制不同豬種病毒復(fù)制曲線
        2.7 高通量測序樣品的準(zhǔn)備
            2.7.1 PAM的培養(yǎng)和處理
            2.7.2 細(xì)胞總RNA的提取
            2.7.3 RNA濃度測定和質(zhì)量檢測
        2.8 Solexa上樣測序、數(shù)據(jù)的產(chǎn)生及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析
            2.8.1 生物信息學(xué)分析流程
            2.8.2 基本生物信息學(xué)分析
            2.8.3 高級生物信息學(xué)分析
        2.9 候選miRNAs的驗證
            2.9.1 總RNA去除基因組污染
            2.9.2 莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成
            2.9.3 cDNA檢測
            2.9.4 miRNAs成熟序列的擴增引物及莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄特異引物的設(shè)計
            2.9.5 miRNAs成熟序列的擴增
            2.9.6 miRNAs成熟序列的克隆鑒定
            2.9.7 實時定量法對miRNAs的驗證
        2.10 半定量法檢測miRNA組織表達(dá)譜
            2.10.1 大白豬各組織樣總RNA的提取
            2.10.2 cDNA的合成
            2.10.3 miRNA組織表達(dá)譜分析
        2.11 miR-210靶基因驗證
            2.11.1 靶基因MX13'UTR的擴增
            2.11.2 pMD18-T片段質(zhì)粒的雙酶切及缺失片段的回收
            2.11.3 pmirGLO載體的構(gòu)建
            2.11.4 pmirGLO質(zhì)粒的中量提取
            2.11.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.11.6 雙熒光素酶報告基因的檢測
第三章 結(jié)果與分析
    1 PAM細(xì)胞PRRSV檢測
    2 不同豬種PRRSV易感性試驗
        2.2 QORF7重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        2.3 不同品種豬PRRSV動力復(fù)制曲線
    3 測序樣品RNA質(zhì)量分析
    4 Solexa文庫測序及生物信息學(xué)分析
        4.1 皮特蘭測序結(jié)果分析
            4.1.1 Solexa文庫概述
            4.1.2 Small RNA長度分布
            4.1.3 小RNA分類注釋
            4.1.4 miRNAs的堿基分布特征
            4.1.5 已知miRNA分析
            4.1.6 候選miRNA預(yù)測
            4.1.7 已知miRNA差異分析
            4.1.8 miRNA靶基因位點預(yù)測
            4.1.9 靶基因的功能注釋
        4.2 清平測序結(jié)果分析
            4.2.1 Solexa文庫概述
            4.2.2 Small RNA長度分布
            4.2.3 小RNA分類注釋
            4.2.4 小RNA與重復(fù)序列比對結(jié)果
            4.2.5 已知miRNA分析
            4.2.6 已知miRNA“種子”區(qū)序列堿基編輯
            4.2.7 候選miRNA預(yù)測
            4.2.8 已知miRNA差異表達(dá)分析
    5 miRNAs實時熒光定量PCR分析驗證
        5.1 RNA的提取
        5.2 cDNA檢測結(jié)果
        5.3 miRNAs成熟序列的擴增
        5.4 miRNAs的實時定量PCR結(jié)果
    6 miRNAs在豬中不同組織中的表達(dá)結(jié)果
    7 MX1雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建結(jié)果
        7.1 MX1 3'UTR序列的擴增
        7.2 pmirGLO MX1 3'UTR重組質(zhì)粒的鑒定
        7.3 雙熒光素酶報告基因的檢測結(jié)果
第四章 討論
    1 試驗樣品的選擇
    2 檢測方法和測序質(zhì)量
    3 miRNA靶基因預(yù)測
    4 miRNA表達(dá)分析
        4.1 實時熒光定量PCR檢測miRNA
        4.2 差異miRNA實時定量驗證
第五章 小結(jié)
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 下一步工作
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNA-124靶標(biāo)功能的生物信息學(xué)挖掘[J]. 魏強,李廣林,郭韜.  生命科學(xué)研究. 2010(05)
[2]豬無名高熱綜合癥[J]. 萬遂如.  養(yǎng)殖與飼料. 2006(10)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征及其在我國的現(xiàn)狀與對策[J]. 蔡雪暉,柴文君,翁長江,劉光清,郭寶清.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2000(S1)
[4]MxA抗病毒蛋白的研究進展[J]. 楊吉成.  蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2000(06)
[5]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國畜禽傳染病. 1996(02)



本文編號：3455779