Sox2基因作為維持胚胎干細(xì)胞自我更新與全能性的關(guān)鍵基因,最近幾年其一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。本研究旨在克隆雞Sox2基因,利用原核表達(dá)技術(shù)獲得純化的His-Sox2融合蛋白,以此為抗原制備雞Sox2多克隆抗體并檢測(cè)其特異性和有效性。從20日齡雞的睪丸組織中提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增Sox2基因編碼序列,并將其克隆到pMD18-T載體。對(duì)確定的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行生物信息學(xué)分析,限制性酶切獲得的Sox2片段亞克隆到pET30-a表達(dá)載體,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-Sox2。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,用異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),用SDS-PAGE電泳及Western blotting檢測(cè)融合蛋白表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件,大量增菌,1.0mmol/L IPTG37℃誘導(dǎo)4h,以Ni-NTA argrose介質(zhì)在變性條件下分離純化His-Sox2融合蛋白。純化的融合蛋白間隔2周,分4次皮下多點(diǎn)注射新西蘭大白兔。最后一次注射后7d,采血分離血清,并以此為第一抗體,分別以純化的His-Sox2融合蛋白和來(lái)自小雞睪丸組織的蛋白樣品作為抗原,借助于Wes... 

【文章來(lái)源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞符號(hào)說(shuō)明
文獻(xiàn)綜述
    第一章 Sox2基因的研究進(jìn)展
        1.1 Sox基因的簡(jiǎn)介
        1.2 Sox2基因的結(jié)構(gòu)特征
        1.3 Sox2基因的主要功能
        1.4 Sox2基因與干細(xì)胞
            1.4.1 Sox2基因與ESCs
            1.4.2 Sox2基因與iPS細(xì)胞
        1.5 生物信息學(xué)應(yīng)用
        1.6 免疫組化概述
            1.6.1 免疫組織化學(xué)的應(yīng)用
        1.7 研究目的與意義
        1.8 實(shí)驗(yàn)路線
試驗(yàn)研究
    第二章 雞Sox2基因的克隆和生物信息學(xué)分析
        2.1 引言
        2.2 材料與方法
            2.2.1 動(dòng)物來(lái)源
            2.2.2 主要試劑
            2.2.3 菌株
            2.2.4 儀器設(shè)備
            2.2.5 常用溶液
            2.2.6 Sox2基因的克隆
        2.3 結(jié)果與分析
            2.3.1 RT-PCR
            2.3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
            2.3.3 測(cè)序結(jié)果
            2.3.4 核苷酸序列同源性分析
            2.3.5 氨基酸序列同源性分析
            2.3.6 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
            2.3.7 Sox2編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)
            2.3.8 Sox2基因的密碼子偏好性推測(cè)
            2.3.9 Sox2蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析
            2.3.10 Sox2蛋白疏水性、親水性及跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            2.3.11 抗原位點(diǎn)
            2.3.12 雞Sox2蛋白的結(jié)構(gòu)分析
            2.3.13 Sox2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 雞Sox2基因的原核表達(dá)與多克隆抗體制備
        3.1 引言
        3.2 材料與方法
            3.2.1 動(dòng)物來(lái)源
            3.2.2 主要試劑
            3.2.3 儀器設(shè)備
            3.2.4 菌株和質(zhì)粒
            3.2.5 pET30a-Sox2原核表達(dá)載體構(gòu)建
            3.2.6 pET30a-Sox2在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.2.7 融合蛋白His-Sox2的純化
            3.2.8 制備兔抗Sox2多克隆抗體
            3.2.9 免疫組織化學(xué)檢測(cè)
        3.3 結(jié)果與分析
            3.3.1 原核表達(dá)與蛋白純化
            3.3.2 融合蛋白Western blotting鑒定
            3.3.3 多克隆抗體特異性檢測(cè)
            3.3.4 Western blottin檢測(cè)
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
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