豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，主要以母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、早產(chǎn)及木乃伊胎等，仔豬和生長豬以呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為特征的接觸性傳染病。該病傳染性強，感染后導(dǎo)致機體的免疫抑制和并發(fā)癥，病毒基因的變異也給防治增加了難度，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的損失。糖基化囊膜蛋白5（GP5）是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有結(jié)合病毒受體及誘導(dǎo)細胞凋亡等功能，該蛋白誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體具有最強的中和能力，在疫苗制備中意義重大，是研制豬繁殖與呼吸綜合征基因工程疫苗的優(yōu)秀候選對象，在研究PRRSV的生理功能及防治過程中也具有重要作用。本研究根據(jù)GenBank中收錄的PRRSV經(jīng)典美洲型毒株和中國的高致病性毒株基因序列比對結(jié)果，用Primer5.0軟件設(shè)計特異性引物，利用RT-PCR擴增整個ORF5基因片段，以pMDl8-T為載體對ORF5基因進行克隆。序列測定表明，ORF5基因全長603bp，編碼201個氨基酸。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計兩對引物（P1/P2，P3/P4），在P1和P4引物中分別設(shè)計EcoRⅤ和HindⅢ酶切位點，在P2和P3引物中均設(shè)計BamHⅠ酶... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征概述
    1.2 病原學(xué)
        1.2.1 PRRSV 分類地位
        1.2.2 PRRSV 形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.3 PRRSV 的生物學(xué)特性
    1.3 流行病學(xué)
    1.4 致病機制和臨床表現(xiàn)
        1.4.1 致病機制
        1.4.2 臨床癥狀
        1.4.3 剖檢病變
    1.5 PRRSV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.5.1 PRRSV 非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.5.2 PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白
    1.6 PRRSV 免疫學(xué)
        1.6.1 體液免疫反應(yīng)
        1.6.2 細胞免疫反應(yīng)
    1.7 PRRSV 實驗室診斷技術(shù)
        1.7.1 病毒分離
        1.7.2 RT-PCR 技術(shù)
        1.7.3 免疫膠體金技術(shù)（IGSS）
        1.7.4 免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)
        1.7.5 間接免疫熒光 (IFA)
        1.7.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
    1.8 PRRSV 防制
    1.9 GP5 蛋白研究進展
    1.10 研究目的及意義
    1.11 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 主要儀器試劑及來源
        2.1.4 主要試劑的配置
            2.1.4.1 EB 溶液的配制
            2.1.4.2 電泳緩沖液
            2.1.4.3 1.0%瓊脂糖凝膠的配置
            2.1.4.4 0.05% Tween-20
            2.1.4.5 0.01M 檸檬酸鹽緩沖液
            2.1.4.6 LB 液體培養(yǎng)基
            2.1.4.7 Buffer B 溶液
            2.1.4.8 不同濃度一抗、二抗
            2.1.4.9 0.01MPBS(1000ml 配制)
            2.1.4.10 細胞生長液
            2.1.4.11 細胞維持液
            2.1.4.12 細胞消化液
    2.2 試驗方法
        2.2.1 細胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)及 PRRSV 增殖
            2.2.1.1 Marc-145 細胞的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)
            2.2.1.2 PRRSV 的增殖
        2.2.2 病毒 RNA 的提取
        2.2.3 病毒 RNA 的反轉(zhuǎn)錄 PCR
        2.2.4 病毒 ORF5 基因的擴增
        2.2.5 陽性 PCR 產(chǎn)物的純化回收
        2.2.6 PCR 產(chǎn)物與載體連接
        2.2.7 感受態(tài)的制備
        2.2.8 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
        2.2.9 陽性質(zhì)粒的提取
        2.2.10 重組質(zhì)粒的的構(gòu)建和鑒定
            2.2.10.1 引物設(shè)計
            2.2.10.2 重組質(zhì)粒 pET-GP5a 質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.10.3 重組質(zhì)粒 pET-GP5 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.11 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
            2.2.11.1 陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達感受態(tài)
            2.2.11.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
            2.2.11.3 SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳
            2.2.11.4 重組蛋白的純化
            2.2.11.5 重組蛋白的 Western blot 檢測
        2.2.12 重組蛋白抗血清的制備
            2.2.12.1 免疫程序
            2.2.12.2 ELISA 檢測
            2.2.12.3 抗血清的制備與純化
        2.2.13 重組蛋白抗血清中和效果的檢測
            2.2.13.1 抗血清中和效果的 ELISA 檢測
            2.2.13.2 抗血清病毒阻斷實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 ORF5 全基因克隆
    3.2 GP5 重組基因表達載體的構(gòu)建
    3.3 蛋白的誘導(dǎo)表達與純化
    3.4 蛋白的 Western-blot 檢測
    3.5 重組蛋白抗血清的制備結(jié)果
    3.6 抗血清中和效果的檢驗結(jié)果
        3.6.1 ELISA 檢測結(jié)果
        3.6.2 抗血清病毒阻斷實驗結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
碩士期間發(fā)表的論文
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]高致病性藍耳病流行的病因分析與防制[J]. 王五州,王建輝.  畜禽業(yè). 2007(10)
[4]高致病性豬藍耳病的綜合防治[J]. 劉國信.  北京農(nóng)業(yè). 2007(22)
[5]豬免疫抑制性疾病的流行特點與控制對策[J]. 楊漢春.  中國畜牧獸醫(yī). 2004(05)
[6]豬繁殖與呼吸綜合征病毒的持續(xù)感染[J]. 劉光清,仇華吉,蔡雪暉,童光志.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2002(04)
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[10]豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染的免疫學(xué)研究進展[J]. 李華,楊漢春,郭玉璞.  中國獸醫(yī)雜志. 1999(09)



本文編號：3451389