豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）率屬于冠狀病毒科中的一員，是豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）的病原，以水樣腹瀉和仔豬高死亡率為主要特征。PEDV N蛋白是目前研究發(fā)現(xiàn)在感染細(xì)胞中產(chǎn)量最多的蛋白，與病毒的致病性息息相關(guān)，因此對(duì)PEDV及PEDV N蛋白與細(xì)胞相互作用開(kāi)展研究，有助于了解PEDV的致病機(jī)制，并為抗病毒策略提供依據(jù).本研究首先針對(duì)PEDV與Vero E6細(xì)胞相互作用進(jìn)行研究。將本實(shí)驗(yàn)保存的PEDV感染VeroE6細(xì)胞，分別在感染后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h消化處理細(xì)胞，借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。分析結(jié)果顯示，在Vero E6細(xì)胞感染PEDV12h后可觀察到細(xì)胞在G2/M期停滯的現(xiàn)象。結(jié)果表明PEDV可能與VeroE6細(xì)胞相互作用來(lái)影響細(xì)胞在G2/M期的進(jìn)程。利用含有抑制細(xì)胞周期的化學(xué)藥物諾考達(dá)唑（60ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero E6細(xì)胞，36h后借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，可觀察到細(xì)胞在G2/M期的停滯現(xiàn)象；利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)VeroE6細(xì)胞... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 PED 概述
        1.1.1 流行病學(xué)
        1.1.2 臨床癥狀
        1.1.3 發(fā)病機(jī)理
        1.1.4 病理變化
        1.1.5 組織嗜性和免疫機(jī)制
        1.1.6 免疫防治措施
        1.1.7 診斷
    1.2 PEDV 的生物學(xué)特性
        1.2.1 PEDV 病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PEDV 理化特性
        1.2.3 PEDV 抗原性
        1.2.4 PEDV 病毒學(xué)分類(lèi)
        1.2.5 PEDV 細(xì)胞培養(yǎng)特性
        1.2.6 PEDV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.7 PEDV 基因組編碼蛋白及其功能
            1.2.7.1 非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
            1.2.7.2 結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
    1.3 冠狀病毒及其蛋白與宿主細(xì)胞周期相互作用的研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 感染豬流行性腹瀉病毒對(duì) VERO E6 細(xì)胞周期的影響
    摘要
    2.1 材料與方法
        2.1.1 病毒與細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 PEDV 的培養(yǎng)
        2.1.4 細(xì)胞周期的檢測(cè)
        2.1.5 細(xì)胞的化學(xué)處理及檢測(cè)
        2.1.6 病毒 RNA 的提取
        2.1.7 病毒 RNA 的反轉(zhuǎn)錄
        2.1.8 病毒載量的檢測(cè)
        2.1.9 數(shù)據(jù)的處理和分析
        2.1.10 相對(duì)熒光定量對(duì)細(xì)胞周期因子及相關(guān)因子的檢測(cè)
            2.1.10.1 熒光定量引物的設(shè)計(jì)
            2.1.10.2 細(xì)胞總 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.1.10.3 常規(guī) PCR 鑒定
            2.1.10.4 PCR 產(chǎn)物的膠回收
            2.1.10.5 純化產(chǎn)物與載體的連接
            2.1.10.6 連接產(chǎn)物的的轉(zhuǎn)化
            2.1.10.7 重組質(zhì)粒的提取
            2.1.10.8 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.1.10.9 熒光定量 PCR 細(xì)胞培養(yǎng)物樣品檢測(cè)
            2.1.10.11 數(shù)據(jù)處理與分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 細(xì)胞周期的檢測(cè)
        2.2.2 化學(xué)藥物處理細(xì)胞
        2.2.3 絕對(duì)熒光定量 PCR 的方法檢測(cè)病毒載量的變化
        2.2.4 相對(duì)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控因子的變化
    2.3 討論
第三章 豬流行性腹瀉病毒 N 蛋白核仁定位信號(hào)對(duì)細(xì)胞周期的影響
    摘要
    3.1 材料、儀器和方法
        3.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.1.3.1 目的基因引物的設(shè)計(jì)
            3.1.3.2 目的基因的擴(kuò)增
            3.1.3.3 N1 和 N2 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收
            3.1.3.4 dN 基因的擴(kuò)增
            3.1.3.5 N 基因和 dN 基因擴(kuò)增基因產(chǎn)物的純化回收
            3.1.3.6 N 基因、dN 基因和載體的酶切連接
            3.1.3.7 轉(zhuǎn)化
            3.1.3.8 質(zhì)粒的提取與鑒定
            3.1.3.9 陽(yáng)性質(zhì)粒的大量提取
        3.1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Vero E6 細(xì)胞
        3.1.5 激光共聚焦顯微鏡分析
        3.1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 N 基因和 dN 基因的獲得
        3.2.2 激光共聚焦顯微鏡分析重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的定位情況
        3.2.3 細(xì)胞流式儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期變化
    3.3 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[8]豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)氫氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗的研究[J]. 馬思奇,王明,馮力,李偉杰.  中國(guó)畜禽傳染病. 1995(06)
[9]豬流行性腹瀉病毒適應(yīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)及以傳代細(xì)胞毒制備氫氧化鋁滅活疫苗免疫效力試驗(yàn)[J]. 馬思奇,王明,周金法,馮力.  中國(guó)畜禽傳染病. 1994(02)
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本文編號(hào)：3451197