睪丸間質(zhì)細(xì)胞是雄性動物分泌睪酮的主要來源，機(jī)體內(nèi)睪酮水平與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，了解睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡的分子機(jī)制，對于充分認(rèn)識精子生成及雄性不育等均有十分重要的意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是蛋白折疊和修飾的重要場所，是真核細(xì)胞的主要細(xì)胞器之一。機(jī)體許多生理和病理因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)失衡并誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），最近的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路參與多種細(xì)胞的死亡過程。本實驗通過明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡過程及信號途徑，為進(jìn)一步揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實驗通過膠原酶法分離培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（Tg）和衣霉素（Tm），采用Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞的凋亡率；應(yīng)用Real-Time PCR方法檢測GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA水平的變化。試驗結(jié)果顯示Tm和Tg顯著的誘導(dǎo)了小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，且呈濃度和時間依賴性。GRP78mRNA的... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：26 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)與純度鑒定（×100）

圖 2 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測間質(zhì)細(xì)胞凋亡率Fig 2 The apoptotic Leydig cells examined by Annexin V-FITC/PI double-labeling2.3.2.2 相關(guān)基因 GRP78、CHOP、Caspase-12 的表達(dá)量體外分離培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在培養(yǎng)液中分別加入 5 μg/mL 和 10 μg/mL 的質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異誘導(dǎo)劑 Tg 與 Tm；在培養(yǎng)的 0 h 、24 h 和 48 h 收集細(xì)胞，采用 Real-tiPCR 技術(shù)檢測 GRP78、CHOP、Caspase-12 表達(dá)水平。添加 ERS 特異誘導(dǎo)劑 Tg 和 T24 h 時，GRP78 mRNA 的表達(dá)水平顯著增加（圖 3，P<0.05），與 24 h 相比，48 h 時 GRPmRNA 的表達(dá)水平逐漸下降但依然顯著高于對照組（P<0.05），ERS 相關(guān)凋亡通路中關(guān)鍵基因 CHOP、Caspase-12 表達(dá)量隨時間的增加和誘導(dǎo)劑濃度的增加而增加。

圖3 體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中 GRP78, CHOP, Caspase-12 表達(dá)水平的檢測Fig3 Abundance of GRP78, CHOP, Caspase-12 mRNA in mouse leydig cells cultured in vitro.2.4 討論近年來關(guān)于 ERS 與凋亡的關(guān)系的研究備受關(guān)注。ERS 與一些疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，心衰、高血壓等心血管疾病、糖尿病、腫瘤性疾病等疾病的發(fā)生，均與 ERS 誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)。目前，ERS 誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡通路機(jī)制報道很少。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是雄性動物分泌睪酮的主要來源，機(jī)體內(nèi)睪酮水平與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。了解睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡的分子機(jī)制，對于充分認(rèn)識精子生成及雄性不育等均有十分重要的意義。睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要分布于曲精小管之間，在睪丸中含量較低，故體外分離培養(yǎng)較難。本實驗通過膠原酶法分離純化小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡過程及信號途徑，為進(jìn)一步揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法多種

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水蘇堿對腎纖維化大鼠腎組織CHOP、caspase-3作用[J]. 張翠,佟倩倩,高佳雪,尚東雨,呂海杰,蘆瑩,康天濟(jì).  哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2014(01)
[2]高糖、高同型半胱氨酸致足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時白藜蘆醇對CHOP通路的影響[J]. 李艷,秦潔,張姬欣,馬春明,柳潔.  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2014(03)
[3]利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案治療非霍奇金淋巴瘤療效分析[J]. 魏濤,龔忠義.  河北醫(yī)學(xué). 2014(01)
[4]苦參素對食管癌Eca-109細(xì)胞BIP和CHOP mRNA表達(dá)的影響[J]. 曹珊,周慧茹,朱艷琴.  鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2014(01)
[5]不同程度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對巨噬細(xì)胞自噬的影響[J]. 馬美娟,李妍,張英梅,閆浩,劉敏,張樂,馬穎,苑健,胡建華,紀(jì)兆樂,張榮慶,李聰葉,王海昌.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2014(02)
[6]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合應(yīng)激反應(yīng)[J]. 陶天琪,劉秀華.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2013(04)
[7]siRNA抑制IRE1α蛋白表達(dá)對巨噬細(xì)胞凋亡的影響[J]. 李方明,郭毅,姜昕,唐冰衫.  中國醫(yī)藥指南. 2013(17)
[8]異氟醚預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注后腸損傷的影響[J]. 柳垂亮,李向宇,程志芳,黃洋,曾維安.  中國藥學(xué)雜志. 2012(21)
[9]毒胡蘿卜素對人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡影響及部分機(jī)制的初步探討[J]. 王亞麗,李俊,黃成,黃艷,于明哲,任丹陽,徐濤.  中國藥理學(xué)通報. 2012(09)
[10]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在軟脂酸鈉誘導(dǎo)的脂肪變性L02肝細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 曹潔,楊朝霞,沈薇,姚隆.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2011(18)



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