傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬成員,主要侵害雛雞體液免疫中樞器官法氏囊中的B淋巴細(xì)胞前體。IBDV基因組由分節(jié)段的A、B片段組成,分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶VP1、衣殼蛋白VP2與VP3、病毒自身的蛋白酶VP4以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5五種蛋白。目前VP4蛋白除作為一種病毒蛋白酶被認(rèn)識(shí)外,其他一無所知,本研究分析了IBDV感染細(xì)胞內(nèi)VP4蛋白的磷酸化修飾及功能。以桿狀病毒表達(dá)的IBDV-VP4蛋白為免疫原,免疫6-8周齡雌性BALB/C小鼠,以HAT篩選培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng),以相應(yīng)的偶聯(lián)多肽和IBDV感染細(xì)胞進(jìn)行ELISA和IFA篩選,結(jié)果獲得6株穩(wěn)定分泌的單克隆抗體細(xì)胞株4A8、5B2、5C7、5C9、7A4和7H8。亞型鑒定結(jié)果顯示它們都是IgGl亞類,輕鏈為K型。結(jié)合表位預(yù)測與合成肽技術(shù),鑒定出4A8、5B2、5C7三株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體共同識(shí)別磷酸化抗原表位VP4-Ser26,而雜交瘤細(xì)胞5C9分泌的單克隆抗體識(shí)別非磷酸化抗原表位12FQVPQNPVVDGILASPGVLR... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：170 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
Abstract
技術(shù)路線
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 傳染性法氏囊病病毒的研究動(dòng)態(tài)
        1 IBDV的病毒學(xué)分類地位
        2 IBDV的基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白
            2.1 非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和功能研究
            2.2 RNA依賴的RNA聚合酶VP1蛋白
            2.3 pVP2、VP2以及4條多肽
            2.4 衣殼蛋白VP3
            2.5 蛋白酶蛋白VP4
            2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白VP5
        3 病毒蛋白、dsRNA之間的相互關(guān)系與病毒粒子的組裝
        4 IBDV的致病性和毒力差異
        5 IBDV和宿主相互作用關(guān)系研究
        6 IBDV編碼蛋白抗原表位研究進(jìn)展
    第二章 病毒蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
        1 病毒蛋白磷酸化與病毒的復(fù)制
        2 病毒蛋白磷酸化與病毒蛋白的位移
        3 病毒蛋白磷酸化與病毒的組裝
        4 病毒蛋白磷酸化與細(xì)胞信號(hào)通路
        5 病毒蛋白磷酸化的其它功能
第二部分 研究內(nèi)容
    第一章 傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白抗原表位分析
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒與細(xì)胞
            1.2 試劑與抗體
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 小鼠免疫
            2.2 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
            2.3 骨髓瘤細(xì)胞制備
            2.4 免疫脾細(xì)胞制備
            2.5 細(xì)胞融合
            2.6 雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化
            2.7 單抗腹水的制備
            2.8 單抗腹水ELISA效價(jià)的測定
            2.9 IFA鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性以及IFA效價(jià)的測定
            2.10 單克隆抗體的Ig亞型測定
            2.11 單克隆抗體的Western-blot鑒定
                2.11.1 樣品準(zhǔn)備
                2.11.2 蛋白濃度的測定
                2.11.3 SDS-PAGE及Western-blot
            2.12 VP4蛋白抗原表位的精細(xì)定位
                2.12.1 包含抗原表位以及磷酸化修飾的多肽設(shè)計(jì)與合成
                2.12.2 多肽的溶解與保存
                2.12.3 多肽與載體蛋白的偶聯(lián)
                2.12.4 偶聯(lián)多肽的透析
                2.12.5 Peptide-ELISA
                2.12.6 Peptide-Dot-ELISA
        3 結(jié)果與分析
            3.1 單抗細(xì)胞建株
            3.2 單克隆抗體特異性和反應(yīng)性鑒定
            3.3 單抗腹水的ELISA效價(jià)、IFA效價(jià)及亞型鑒定
            3.4 IBDV VP4蛋白單克隆抗體的抗原表位鑒定
            3.5 磷酸化單抗和非磷酸化單抗反應(yīng)差異性比較
            3.6 制備的磷酸化單抗與商業(yè)化通用型磷酸化單抗的比較
            3.7 表位的同源性分析
        4 討論
    第二章 傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修飾的細(xì)胞內(nèi)分布與功能分析
        摘要
        1 材料
            1.1 病毒、細(xì)胞、載體和抗體
            1.2 試劑、材料和儀器
        2 方法
            2.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在細(xì)胞中分布
                2.1.1 間接免疫熒光雙標(biāo)檢測IBDV感染DF-1細(xì)胞中VP4分布
                2.1.2 直接免疫熒光雙標(biāo)法檢測IBDV感染DF-1細(xì)胞VP4分布
                2.1.3 IFA檢測重組桿狀病毒rBV-aVP4、pVP4感染High 5細(xì)胞中VP4分布
            2.2 免疫共沉淀
            2.3 去磷酸化對VP4蛋白分布的影響
                2.3.1 點(diǎn)突變載體構(gòu)建
                2.3.2 帶有點(diǎn)突變的超純質(zhì)粒抽提
                2.3.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及蛋白表達(dá)檢測
            2.4 VP4去磷酸化后多聚蛋白VP243在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
                2.4.1 多聚蛋白VP243重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.4.2 超純質(zhì)粒抽提
                2.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以及樣品制備
                2.4.4 SDS-PAGE和Western blot分析
            2.5 VP4蛋白去磷酸化后多聚蛋白VP243體外的轉(zhuǎn)錄翻譯
                2.5.1 超純質(zhì)粒抽提
                2.5.2 體外轉(zhuǎn)錄翻譯
                2.5.3 SDS-PAGE和Western blot分析
            2.6 SDS-PAGE以及Western-blot檢測桿狀病毒表達(dá)VP4蛋白
            2.7 細(xì)胞蛋白組分的分步抽提以及Western blot分析
                2.7.1 細(xì)胞蛋白的分步抽提
                2.7.2 抽提蛋白的丙酮沉淀
                2.7.3 蛋白濃度的測定
                2.7.4 SDS-PAGE以及Western-blot
            2.8 熒光定量PCR檢測病毒編碼蛋白對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的影響
                2.8.1 引物設(shè)計(jì)
                2.8.2 超純質(zhì)粒抽提
                2.8.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
                2.8.4 細(xì)胞總RNA的抽提
                2.8.5 反轉(zhuǎn)錄
                2.8.6 Real-time PCR與數(shù)據(jù)分析
        3 結(jié)果與分析
            3.1 磷酸化和非磷酸化VP4蛋白在病毒感染細(xì)胞中的分布
                3.1.1 IBDV感染DF-1細(xì)胞中VP4蛋白的分布
                3.1.2 桿狀病毒表達(dá)的VP4蛋白在High5細(xì)胞中的分布情況
            3.2 點(diǎn)突變真核表達(dá)載體構(gòu)建
            3.3 去磷酸化點(diǎn)突變VP4在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)動(dòng)態(tài)
            3.4 VP4多位點(diǎn)去磷酸化后多聚蛋白VP243的表達(dá)
            3.5 VP4多位點(diǎn)去磷酸化突變的VP243的體外轉(zhuǎn)錄翻譯
            3.6 VP4蛋白的亞細(xì)胞分布
                3.6.1 磷酸化VP4蛋白在IBDV感染的DF-1細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布
                3.6.2 磷酸化VP4蛋白在重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布
            3.7 IBDV編碼蛋白對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄本的影響
        4 討論
            4.1 IBDV VP4蛋白是一種磷酸化蛋白
            4.2 四個(gè)磷酸化位點(diǎn)對VP4蛋白定位和分布的影響
            4.3 Tyr99和Thr162位點(diǎn)對VP4蛋白剪切功能的影響
            4.4 VP4蛋白主要存在于細(xì)胞骨架組分中
            4.5 VP4蛋白對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄本的影響
    第三章 VP4與IBDV其它編碼蛋白的互作研究
        摘要
        1 材料
            1.1 試劑
            1.2 單克隆抗體和多克隆抗體
            1.3 細(xì)胞、病毒和載體
        2 方法
            2.1 轉(zhuǎn)染用超純質(zhì)粒抽提
            2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.3 間接免疫熒光(IFA)
            2.4 免疫熒光雙標(biāo)
            2.5 免疫共沉淀
        3 結(jié)果與分析
            3.1 VP4蛋白與其它IBDV編碼蛋白在細(xì)胞中的定位關(guān)系
                3.1.1 VP4與VP1的共定位
                3.1.2 VP4與VP2的共定位
                3.1.3 VP4與VP3的共定位
                3.1.4 VP4與VP5的共定位
                3.1.5 VP2與VP3的共定位
                3.1.6 VP2、VP3以及VP4的共定位
            3.2 免疫共沉淀分析VP4蛋白與VP1、VP3蛋白的關(guān)系
                3.2.1 病毒感染情況下非磷酸化VP4蛋白與VP1、VP3蛋白的關(guān)系
                3.2.2 病毒感染情況下pS26-VP4蛋白與VP1、VP3蛋白的關(guān)系
                3.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況下VP4蛋白與VP3蛋白的相互關(guān)系
        4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
第三部分 附錄
    附錄A 縮略詞
    附錄B 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方
    附錄C 攻博期間發(fā)表或錄用的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]傳染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)[J]. 周繼勇,葉菊秀,葉偉成,陳慶新,鄭肖娟,郭軍慶.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2005(01)

碩士論文
[1]A組羊輪狀病毒LLR VP4單克隆抗體的制備與特性研究[D]. 王三應(yīng).華中師范大學(xué) 2009
[2]傳染性法氏囊病病毒VP2、VP3蛋白抗原表位分析與定位研究[D]. 鄧小蕓.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2007
[3]抗雞傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體的制備及抗原表位初步分析[D]. 程宇.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3435330