兔出血癥病毒衣殼蛋白的生物信息學分析及二價VLPs疫苗的研制
發(fā)布時間：2021-10-13 06:11
兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）能引起多品種兔（Oryctolagus cuniculus）的急性、致死性傳染病——兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease,RHD）,俗稱“兔瘟”。雖然兔病毒性出血癥病毒僅有一種血清,但是卻已遺傳演化出多個不同的基因型,并導致其致病性和抗原發(fā)生變化。目前,我們對RHDV的致病機理以及不同基因型（主要是RHDV2/b與classic RHDV）之間的抗原變異機制還存在較多的盲點。更缺乏可以同時抵抗RHDV2/b和classic RHDV感染的的新型疫苗。鑒于此,本論文首先利用生物信息學軟件比較和分析了classic RHDV和RHDV2/b的基因序列及衣殼蛋白生物信息特征的差異。然后,利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng),構建了一種可同時表達classic RHDV-VP60和RHDV2-VP60的重組桿狀病毒,最后通過動物實驗對重組桿狀病毒的免疫原性進行了評估,為進一步研制兔瘟二價疫苗奠定了基礎。本論文研究內(nèi)容主要包括以下三個方面:（1）對RHDV基因組的生物信息學分析:使...
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同亞型RHDV系統(tǒng)進化樹
中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文第二章不同亞型兔出血癥病毒衣殼蛋白的生物信息學分析182.3.2基因重組分析從理論上講，因為一個基因的不同序列之間具有緊密的聯(lián)系所以它們應該具有相似的進化過程。然而，不同序列之間的基因重組可能會影響這個進化過程，同時也有大量研究表明不同亞型RHDV之間的基因重組是廣泛存在的。為了確定不同亞型RHDV之間的潛在的適應性變化，采用RDPv4.56軟件對184個RHDV基因組序列進行基因重組檢測，檢測結果表明有8株RHDV毒株可能發(fā)生了基因重組——MF598302,MF421679,KP129396,KY628317,KY765609,KY628317,EF558585,EF558586（表2-2）。采用Simplotprogram軟件對基因重組的位置進行檢測發(fā)現(xiàn)，所有的基因重組都位于ORF1s，而不是ORF2s（圖2-2）。最后，這些可能發(fā)生了基因重組的序列在后續(xù)的分析中被移除以消除基因重組可能產(chǎn)生的影響。圖2-2Simplot的基因重組分析A：RHDVORF1s基因重組的Simplot相似性分析;B：RHDVORF1s基因重組的Bootscanning驗證;C：RHDVORF2s基因重組的Simplot相似性分析;D：RHDVORF1s基因重組的Bootscanning驗證:Fig.2-2RecombinationanalysisbySimplot.(A)NucleotidesequencedivergencescansofRHDVORF1s.(B)NucleotidesequenceBootscanningofRHDVORF1s.(C)NucleotidesequencedivergencescansofRHDVORF2s.(D)NucleotidesequenceBootscanningofRHDVORF2s.2.3.3不同亞型RHDV的適應多樣性分析采用MKtest對不同亞型的RHDV和RCV的單個蛋白進行適應多樣性分析發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白蛋白經(jīng)歷了不同的進化過程，且氨基酸發(fā)生了適應性突變（表2-3）。根據(jù)Fisher’sexacttest的獨立性分析發(fā)現(xiàn)，VP60同亞型錯義突變和同義突變的比值顯著大于不同亞型錯義突變和同義突變
中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文第二章不同亞型兔出血癥病毒衣殼蛋白的生物信息學分析22圖2-3不同亞型RHDVVP60P2subdomain的氨基酸序列分析Fig.2-3SequencealignmentofVP60P2subdomainofdifferentsbutypesofRHDVN糖基化修飾及磷酸化修飾被證明對病毒蛋白的生物學功能有十分重要的作用，并且可能會影響病毒的復制、翻譯和傳播。對不同亞型RHDV衣殼蛋白VP60的潛在N糖基化修飾位點和磷酸化修飾位點進行預測。ClassicRHDV、RHDVa和RHDV2的衣殼蛋白VP60分別有7個、8個和5個潛在糖基化修飾位點（圖2-4）。有趣的是，與classicRHDV相比，RHDVa有兩個特異性潛在N糖基化修飾位點（aa307and414inVP60）而缺少一個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa369inVP60)。此外，與classicRHDV相比，RHDV2有兩個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa301and362inVP60)而缺少一個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa45,308,and474inVP60)。RHDV2衣殼蛋白VP60的特異性N糖基化修飾可能導致其宿主特異性的改變。ClassicRHDV、RHDVa和RHDV2的衣殼蛋白VP60分別有19、21和13個潛在磷酸化修飾位點（圖2-5）。RHDVa和RHDV2分別有不同于classicRHDV的特異性潛在磷酸化修飾位點，這些修飾位點的差異可能導致不同亞型RHDV之間的生物學特性的差異。
本文編號：3434103
【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
不同亞型RHDV系統(tǒng)進化樹
中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文第二章不同亞型兔出血癥病毒衣殼蛋白的生物信息學分析182.3.2基因重組分析從理論上講，因為一個基因的不同序列之間具有緊密的聯(lián)系所以它們應該具有相似的進化過程。然而，不同序列之間的基因重組可能會影響這個進化過程，同時也有大量研究表明不同亞型RHDV之間的基因重組是廣泛存在的。為了確定不同亞型RHDV之間的潛在的適應性變化，采用RDPv4.56軟件對184個RHDV基因組序列進行基因重組檢測，檢測結果表明有8株RHDV毒株可能發(fā)生了基因重組——MF598302,MF421679,KP129396,KY628317,KY765609,KY628317,EF558585,EF558586（表2-2）。采用Simplotprogram軟件對基因重組的位置進行檢測發(fā)現(xiàn)，所有的基因重組都位于ORF1s，而不是ORF2s（圖2-2）。最后，這些可能發(fā)生了基因重組的序列在后續(xù)的分析中被移除以消除基因重組可能產(chǎn)生的影響。圖2-2Simplot的基因重組分析A：RHDVORF1s基因重組的Simplot相似性分析;B：RHDVORF1s基因重組的Bootscanning驗證;C：RHDVORF2s基因重組的Simplot相似性分析;D：RHDVORF1s基因重組的Bootscanning驗證:Fig.2-2RecombinationanalysisbySimplot.(A)NucleotidesequencedivergencescansofRHDVORF1s.(B)NucleotidesequenceBootscanningofRHDVORF1s.(C)NucleotidesequencedivergencescansofRHDVORF2s.(D)NucleotidesequenceBootscanningofRHDVORF2s.2.3.3不同亞型RHDV的適應多樣性分析采用MKtest對不同亞型的RHDV和RCV的單個蛋白進行適應多樣性分析發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白蛋白經(jīng)歷了不同的進化過程，且氨基酸發(fā)生了適應性突變（表2-3）。根據(jù)Fisher’sexacttest的獨立性分析發(fā)現(xiàn)，VP60同亞型錯義突變和同義突變的比值顯著大于不同亞型錯義突變和同義突變
中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文第二章不同亞型兔出血癥病毒衣殼蛋白的生物信息學分析22圖2-3不同亞型RHDVVP60P2subdomain的氨基酸序列分析Fig.2-3SequencealignmentofVP60P2subdomainofdifferentsbutypesofRHDVN糖基化修飾及磷酸化修飾被證明對病毒蛋白的生物學功能有十分重要的作用，并且可能會影響病毒的復制、翻譯和傳播。對不同亞型RHDV衣殼蛋白VP60的潛在N糖基化修飾位點和磷酸化修飾位點進行預測。ClassicRHDV、RHDVa和RHDV2的衣殼蛋白VP60分別有7個、8個和5個潛在糖基化修飾位點（圖2-4）。有趣的是，與classicRHDV相比，RHDVa有兩個特異性潛在N糖基化修飾位點（aa307and414inVP60）而缺少一個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa369inVP60)。此外，與classicRHDV相比，RHDV2有兩個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa301and362inVP60)而缺少一個特異性潛在N糖基化修飾位點(aa45,308,and474inVP60)。RHDV2衣殼蛋白VP60的特異性N糖基化修飾可能導致其宿主特異性的改變。ClassicRHDV、RHDVa和RHDV2的衣殼蛋白VP60分別有19、21和13個潛在磷酸化修飾位點（圖2-5）。RHDVa和RHDV2分別有不同于classicRHDV的特異性潛在磷酸化修飾位點，這些修飾位點的差異可能導致不同亞型RHDV之間的生物學特性的差異。
本文編號：3434103
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