豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是導(dǎo)致豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的致病病原,PRRSV對易感細胞有著嚴格的細胞趨向性,該病毒主要感染單核-巨噬細胞系,包括其天然易感宿主細胞--豬肺泡巨噬細胞（PAMs）。PRRSV入侵易感細胞系需要多種因子的介導(dǎo),包括CD163,非肌肉肌球蛋白重鏈9（MYH9）,唾液酸黏附素（Sn）,硫酸乙酰肝素（HS）,Vimentin,CD151,CD209等。前人以及本實驗室的研究結(jié)果顯示,CD163和MYH9是PRRSV入侵易感細胞的兩個不可或缺的受體或輔助受體蛋白,但是這兩個蛋白在病毒感染過程中是否存在相互作用還未可知。因此,本研究對CD163與MYH9的相互作用及其在PRRSV入侵易感細胞系中的作用機制展開了一系列的探討。主要得到以下結(jié)果:1.通過免疫共沉淀實驗,我們發(fā)現(xiàn)CD163和MYH9在PRRSV天然宿主細胞PAMs中存在相互作用現(xiàn)象,并且該互作并不依賴于病毒的感染狀態(tài)。2.在HEK293T細胞中,我們將構(gòu)建的CD163和MYH9截短表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,免疫共沉淀實驗結(jié)果表明CD163氨基端4個串聯(lián)重復(fù)的SRCR結(jié)構(gòu)域SRCR1-4與MYH9羧基... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進展
    1.1 PRRSV起源
    1.2 PRRSV臨床癥狀
    1.3 PRRSV病理變化
    1.4 PRRSV基因組組成
    1.5 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白
    1.6 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白
    1.7 PRRSV疫苗防控
第二章 豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體研究進展
    2.1 CD163
    2.2 非肌肉肌球蛋白重鏈 9(MYH9)
    2.3 唾液酸黏附素(Sn)
    2.4 其他受體分子
    2.5 本研究的目的與意義
第三章 CD163與MYH9互作區(qū)域鑒定
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞,質(zhì)粒和病毒
        3.1.2 實驗試劑與主要耗材
        3.1.3 主要實驗儀器設(shè)備
        3.1.4 主要緩沖液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 免疫共沉淀實驗驗證PAMs內(nèi)CD163與MYH9的互作
        3.2.2 PAMs膜蛋白提取
        3.2.3 免疫共沉淀實驗驗證CD163與MYH9的互作區(qū)域
        3.2.4 Western Blot檢測蛋白表達
        3.2.5 原核表達系統(tǒng)表達純化蛋白
        3.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測SRCR1-4 與PRA蛋白的直接互作
        3.2.7 Far-Western Blot檢測SRCR1-4 與PRA的直接互作
        3.2.8 Confocal驗證重組表達的SRCR1-4 與PAMs細胞膜上MYH9的共定位
        3.2.9 免疫共沉淀驗證重組表達的SRCR1-4 與PAMs細胞膜上MYH9的互作
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 CD163與MYH9在PAMs中相互作用
        3.3.2 CD163蛋白的N端結(jié)構(gòu)域SRCR1-4 與MYH9蛋白的C端區(qū)域PRA相互作用
        3.3.3 SRCR1-4 蛋白表達與純化
        3.3.4 SRCR1-4 與PRA直接相互作用
        3.3.5 SRCR1-4 蛋白與PAMs膜上分布的MYH9相互作用
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 SRCR1-4 與PRA的互作對PRRSV感染的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細胞,質(zhì)粒和病毒
        4.1.2 實驗試劑和主要耗材
        4.1.3 主要實驗儀器設(shè)備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 穩(wěn)定表達CD163及其截短片段的HEK293T細胞系構(gòu)建
        4.2.2 免疫共沉淀檢測HEK293T細胞系中CD163與MYH9的互作
        4.2.3 PRRSV在HEK293T穩(wěn)篩細胞系中吸附,內(nèi)化,解離,復(fù)制過程的分析
        4.2.4 PRRSV在HEK293TCD163,HEK293TSRCR1-4,HEK293TSRCR5-CT細胞系中的復(fù)制差異分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)細胞系的建立與鑒定
        4.3.2 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)細胞系中CD163與MYH9的互作
        4.3.3 SRCR1-4 對于PRRSV在易感細胞內(nèi)的入侵發(fā)揮重要作用
        4.3.4 SRCR1-4 的表達影響PRRSV的復(fù)制效率
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 重組表達SRCR1-4 蛋白對PRRSV感染的抑制作用
    5.1 實驗材料
        5.1.1 細胞,病毒和蛋白
        5.1.2 實驗試劑和主要耗材
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 實驗方法
        5.2.1 原核表達的SRCR1-4 蛋白對PRRSV在PAMs中內(nèi)化的影響
        5.2.2 不同濃度的SRCR1-4 蛋白孵育PAMs后對II型PRRSV的抑制作用
        5.2.3 SRCR1-4 蛋白對細胞的毒性檢測
        5.2.4 重組SRCR1-4 蛋白對I,II型PRRSV的廣譜性抑制作用
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 重組SRCR1-4 蛋白抑制PRRSV在PAMs中的內(nèi)化過程
        5.3.2 重組SRCR1-4 蛋白對PRRSV具有廣譜性抑制作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 CD163與MYH9互作區(qū)域的表達與純化
    6.1 實驗材料
        6.1.1 細胞與質(zhì)粒
        6.1.2 主要試劑耗材
        6.1.3 主要實驗儀器設(shè)備
    6.3 實驗方法
        6.3.1 Far-Western Blot鑒定SRCR1-4 蛋白與截短PRA片段之間的互作
        6.3.2 His-pull down檢測SRCR1-4 與截短PRA蛋白之間的相互作用
        6.3.3 SRCR1-4 與PRA互作區(qū)域的表達純化
        6.3.4 真核表達的PRA100與原核表達的SRCR1-4 蛋白之間的互作檢測
        6.3.5 穩(wěn)定分泌表達 CD163 胞外區(qū)蛋白（SRCR1-PSTII）的 293s 懸浮細胞系構(gòu)建
        6.3.6 SRCR1-PSTII蛋白的純化
        6.3.7 SRCR1-PSTII蛋白透射電鏡觀察
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 CD163 SRCR1-4 蛋白與PRA截短片段之間的互作
        6.4.2 PRA100蛋白的表達純化
        6.4.3 真核表達的PRA100與原核表達SRCR1-4 蛋白之間的互作
        6.4.4 CD163胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域SRCR1-PSTII蛋白的表達與純化
        6.4.5 SRCR1-PSTII透射電鏡觀察
    6.5 討論
    6.6 小結(jié)
全文總結(jié)
本研究創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Review for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Tao XING,Xingxing YU,Jun ZHANG,Hongfei ZHANG,Haigen WANG,Guangsheng ZHOU,Min ZHANG,Chuanmin LIU,Jingui LI.  Agricultural Science & Technology. 2017(01)

博士論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗獨特型抗體Mab2-5G2與MYH9蛋白互作的研究[D]. 李亮亮.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018



本文編號：3432623