豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,可引起豬急性、高度接觸性、傳染性腸道疾病——豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）。自2010年以來,TGE在我國多個省市的暴發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,制約了我國規(guī)�；i場的健康高速發(fā)展。TGEV致病機制的研究有助于對TGE的防控。有研究報道TGEV感染可以誘導(dǎo)I型干擾素（IFN）的產(chǎn)生。IFN及其下游的干擾素刺激因子（ISGs）能夠有效的抑制病毒感染和病毒在體內(nèi)的增殖,是宿主抗病毒感染的重要環(huán)節(jié)。多數(shù)病毒感染是拮抗IFN產(chǎn)生的,而TGEV感染細胞后可以誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生,目前對其具體分子機制的相關(guān)研究報道較少。本研究使用TGEV HE-1株在IPEC-J2細胞上傳代適應(yīng),盲傳至第八代時,細胞開始出現(xiàn)典型的細胞病變（cytopathic effect,CPE）,經(jīng)RT-PCR驗證TGEV HE-1株可以在IPEC-J2細胞上適應(yīng),熒光顯微鏡下可觀察到隨著感染病毒滴度的增加,綠色熒光信號逐漸增強。T... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 豬傳染性胃腸炎概述
    1.2 TGEV病原學(xué)
        1.2.1 TGEV生物學(xué)分類及形態(tài)學(xué)特征
        1.2.2 TGEV理化性質(zhì)及體外培養(yǎng)特性
    1.3 TGEV分子生物學(xué)特征
        1.3.1 TGEV基因組結(jié)構(gòu)
        1.3.2 TGEV結(jié)構(gòu)蛋白及生物學(xué)功能
    1.4 豬小腸黏膜上皮細胞(IPEC-J2)
    1.5 天然免疫概述
        1.5.1 天然免疫簡介
        1.5.2 I型IFN概述
        1.5.3 IFN-β轉(zhuǎn)錄激活機制
        1.5.4 干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-
    1.6 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞、病毒、菌種和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑、工具酶和抗體
        2.1.3 實驗試劑的配制
        2.1.4 實驗儀器
        2.1.5 引物設(shè)計
        2.1.6 siRNA的合成
    2.2 實驗方法
        2.2.1 TGEV感染IPEC-J2細胞及RT-PCR檢測
        2.2.2 Real-time RT-PCR檢測TGEV在IPEC-J2細胞上盲傳病毒的增殖
        2.2.3 TGEV在IPEC-J2細胞上的病毒滴度和生長曲線測定
        2.2.4 TGEV間接免疫熒光(IFA)檢測
        2.2.5 TGEV結(jié)構(gòu)蛋白真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        2.2.6 TGEV重組質(zhì)粒和siRNA的轉(zhuǎn)染
        2.2.7 IPEC-J2細胞的細胞核和細胞質(zhì)蛋白提取
        2.2.8 Western blot檢測蛋白表達情況
        2.2.9 雙熒光素酶檢測啟動子活性
        2.2.10 激光共聚焦顯微鏡觀察
        2.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
3 結(jié)果
    3.1 TGEV感染IPEC-J2細胞
        3.1.1 TGEV在IPEC-J2細胞上增殖的RT-PCR檢測
        3.1.2 TGEV在IPEC-J2細胞上增殖的Real-time RT-PCR檢測方法建立
        3.1.3 TGEV在IPEC-J2細胞上的病毒滴度和生長曲線
        3.1.4 TGEV感染IPEC-J2細胞的IFA檢測
    3.2 TGEV感染IPEC-J2細胞誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的分子機制研究
        3.2.1 TGEV感染激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄
        3.2.2 TGEV感染依賴于IRF-3激活I(lǐng)FN-β信號通路
        3.2.3 TGEV感染對IRF-3的影響
    3.3 TGEV M蛋白激活I(lǐng)FN-β產(chǎn)生
        3.3.1 TGEV各結(jié)構(gòu)蛋白基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 TGEV各結(jié)構(gòu)蛋白基因真核表達質(zhì)粒的鑒定
        3.3.3 TGEV激活I(lǐng)FN-β表達的結(jié)構(gòu)蛋白確定
        3.3.4 TGEV M蛋白激活I(lǐng)FN-β表達的分子機制
    3.4 TGEV M蛋白激活I(lǐng)FN-β表達功能域的確定
        3.4.1 TGEV M蛋白截短基因的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
        3.4.2 TGEV M蛋白激活I(lǐng)FN-β表達功能域的確定
4 討論
    4.1 TGEV HE-1 株在IPEC-J2細胞上傳代適應(yīng)
    4.2 提高TGEV各蛋白在IPEC-J2細胞中表達方法的優(yōu)化
    4.3 TGEV感染IPEC-J2細胞誘導(dǎo)IFN-β表達上調(diào)的分子機制
    4.4 TGEV M蛋白激活I(lǐng)FN-β表達的功能域確定
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3429685