啟動子是一段能起始下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控序列,選擇合適的啟動子可以驅(qū)使目的基因在特定的組織表達,如消化道特異性啟動子驅(qū)動植酸酶基因在消化道內(nèi)表達或骨骼肌特異性啟動子驅(qū)動脂肪相關基因在肌肉中表達。PPARy （Peroxisome Proliferator-Activated Receptors y）基因作為研究肌內(nèi)脂肪含量的候選主效基因,能調(diào)控脂肪細胞的分化及脂肪沉積。因此,設想通過肌肉組織特異性啟動子提高PPARy在肌肉中的表達,增加肌肉中脂肪的沉積,以提高肌內(nèi)脂肪的含量。本研究通過克隆,篩選及功能驗證肌肉組織特異性表達基因myozl （Myozenin1）和tnnc2（Fast Skeletal Muscle Troponin C）的啟動子區(qū)域,獲得具有肌肉組織特異性調(diào)控功能的核心啟動子,再利用核心啟動子成功調(diào)控外源基因PPARy在成肌細胞中表達,為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型提供一定的理論基礎。取得結(jié)果如下：（1）根據(jù)進化印記法理論,采用軟件MEME分析myozl及tnnc2的調(diào)控區(qū)域,發(fā)現(xiàn)myozl調(diào)控區(qū)域的保守序列集中在第一外顯子5’端附近,而tnnc2調(diào)控區(qū)域的保守序列集中在第一外... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 啟動子概述
        1.1 啟動子的分類
        1.2 核心啟動子調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)
        1.3 其它重要調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)
    2 啟動子的研究方法
        2.1 基于常規(guī)試驗的研究方法
            2.1.1 啟動子序列的克隆方法
            2.1.2 啟動子功能的分析方法
        2.2 基于生物信息學理論的啟動子分析方法
    3 myoz1及tnnc2啟動子研究現(xiàn)狀
        3.1 myoz1啟動子研究現(xiàn)狀
        3.2 tnnc2啟動子的研究現(xiàn)狀
    4 PPARγ的概述
    5 研究目的及意義
第二章 材料與方法
    1 試驗材料
        1.1 DNA樣品
        1.2 載體和菌株
        1.3 試劑及其配置
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑的配置
        1.4 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
    2 試驗方法
        2.1 豬myoz1和tnnc2基因啟動子的克隆及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 豬myoz1和tnnc2調(diào)控序列的獲得
            2.1.2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的分析及缺失片段設計
            2.1.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測和回收
            2.1.4 PCR產(chǎn)物及pGL3-basic載體雙酶切及回收
            2.1.5 pGL3-basic缺失重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 細胞培養(yǎng)及誘導分化
            2.2.1 細胞的復蘇
            2.2.2 細胞的常規(guī)培養(yǎng)
            2.2.3 細胞凍存
            2.2.4 C2C12細胞的誘導分化
        2.3 細胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性的測定
            2.3.1 細胞的轉(zhuǎn)染
            2.3.2 雙熒光素酶相對活性的檢測
            2.3.3 數(shù)據(jù)的處理及分析
        2.4 pEGFP-N1重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5 增強型綠色熒光蛋白表達的觀測
        2.6 核心啟動子與PPARγ基因的重組構(gòu)建
            2.6.1 豬PPARγ基因CDS區(qū)域的克隆
            2.6.2 豬PPARγ重組質(zhì)粒的鑒定
        2.7 C2C12細胞的PPARγ表達量測定
            2.7.1 C2C12細胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12細胞中的表達量
            2.7.3 C2C12細胞蛋白質(zhì)的提取
            2.7.4 Western blot檢測PPARγ蛋白的表達
        2.8 PPARγ重組表達質(zhì)粒的線性化
第三章 結(jié)果與分析
    1 豬myoz1和tnnc2啟動子功能分析及驗證
        1.1 豬myoz1和tnnc2啟動子的生物信息學分析
            1.1.1 MEME分析豬myoz1和tnnc2調(diào)控區(qū)域
            1.1.2 調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測
        1.2 豬myoz1和tnnc2啟動子的克隆及缺失重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.3 C2C12細胞的誘導分化
        1.4 豬myoz1和tnnc2啟動子及缺失重組質(zhì)粒的雙熒光素酶活性檢測
        1.5 pEGFP-N1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及綠色熒光蛋白的檢測
    2 豬PPARγ表達載體的構(gòu)建及表達量的測定
        2.1 豬PPARγ表達載體的構(gòu)建
        2.2 定量PCR檢測C2C12細胞中PPARγ的表達量
        2.3 western blot檢測PPARγ蛋白的表達
第四章 討論
    1 進化印記法分析啟動子
    2 豬myoz1及tnnc2啟動子在小鼠C2C12、分化后的C2C12、3T3-L1細胞中的活性分析
    3 tnnc2啟動子可能存在的一段增強子序列
    4 MEF-2、MyoD影響myoz1及tnnc2的啟動子活性
    5 增強啟動子活性以提高外源PPARγ的表達
第五章 小結(jié)
    1 本研究取得的成果
    2 下一步工作計劃
參考文獻
附錄一：豬myoz1基因核心啟動子序列
附錄二：豬tnnc2基因核心啟動子序列
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]牛Sry啟動子調(diào)控序列的鑒定[J]. 韓鳳桐,林秀坤,劉娣,吳寧,廖冰.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2010(14)
[2]擬南芥鹽脅迫響應啟動子的生物信息學分析[J]. 吳炳江,閻鵬磊,劉東籬,鄭成超,楊國棟.  山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2010(02)
[3]啟動子序列克隆和功能分析方法的研究進展[J]. 楊曉娜,趙昶靈,李云,李會容,蘇麗,周燕瓊.  云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2010(02)
[4]人類基因組中的保守非編碼元件[J]. 田靖,趙志虎,陳惠鵬.  遺傳. 2009(11)
[5]中國李pgip啟動子的克隆及調(diào)控元件分析[J]. 李廣平,張長青,章鎮(zhèn),曹福亮.  園藝學報. 2009(10)
[6]豬Calsarcin-2基因編碼區(qū)的克隆及組織表達譜分析[J]. 蘇玉虹,劉東鑫,宋慧娟,曾瑞霞,巴彩鳳,王洪才.  遼寧醫(yī)學院學報. 2008(05)
[7]VEGFR3基因啟動子中的功能區(qū)段預測[J]. 焦吉祥,張長青,王進.  藥物生物技術(shù). 2008(04)
[8]豬骨骼肌快肌肌鈣蛋白C2基因的cDNA克隆與表達分析[J]. 田興國,陳瑤生,凌飛,梅盈潔,王翀,羅永發(fā),李加琪.  遺傳. 2006(08)
[9]增強子作用機制的研究進展[J]. 賈春平,曾溢滔.  生命科學. 2002(02)

博士論文
[1]日糧能量水平對豬肌內(nèi)脂肪沉積的影響及作用機制研究[D]. 劉作華.四川農(nóng)業(yè)大學 2008
[2]肌肉中calsarcin基因的差異表達和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D]. 王恒.華中農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3425175